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1、1,菌种选育,第二章,2,工业上常用的微生物:,细菌酶制剂、有机酸、氨基酸 、构建基因工程菌等； 放线菌抗生素、维生素、酶制剂、石油脱蜡、污水处理； 霉菌酿酒、制酱、酶制剂、 抗生素、有机酸、饲料等；,3,酵母菌酿酒、面食、菌体蛋白、脂肪酶等； 担子菌（菇类）多糖、橡胶物质、药物等； 藻类保健品、饲料、蛋白质、产能源等。,工业上常用的微生物:,4,出发菌株的来源： 购买菌种保藏机构 采样自然界获取,2.1 生产菌种的来源,生产菌种的来源,5,2.1.1 购买,对于已发现的微生物，可向有关菌种保藏机构购买。 购买菌株的用途： 作为改良菌种的出发菌株 作为模型菌株 直接用于生产,生产菌种的来源,6
2、,2.1.2 采样,2.1.2.1 采样的依据 筛选目的 微生物分布概况 菌种的主要特征与外界环境的关系,生产菌种的来源,7,枯枝败叶,产纤维素酶菌种,海洋,嗜盐菌,产蛋白酶菌种,腐败的鱼虾,生产菌种的来源,8,油田,石油菌,土壤是微生物的大本营,生产菌种的来源,9,2.1.2.2 采样的方法 采样前准备 预先准备灭过菌的牛皮纸、塑料袋、试管、培养皿等无菌容器。 采样的方法 采集含目标微生物的样品，装入无菌容器中，密封包扎后，记录时间、地点、环境等信息。 采土样的方法 去除表土，取离地面515cm处的土壤几十克，盛入无菌容器封存，记录信息，以备查考。,生产菌种的来源,10,2.1.3 标本的预
3、处理,物理法 热处理法分离耐热菌 例：100,1h/40,26h，处理土壤、根土，筛选链霉菌属、马杜拉菌属、小双孢菌属 膜过滤或离心分离细菌和真菌 空气搅拌（发霉的稻草等材料）法分离产孢子的霉菌或放线菌 化学法 向土壤中加入CaCO3提高pH值分离出链霉菌。,生产菌种的来源,11,诱饵法 用特异性的营养成分聚集培养目标菌种。 直接将选择性培养基加入待取样的土壤或水中； 棒上涂特异性培养基，插入待取样的环境中。 例：用石蜡棒从土壤中分离诺卡氏菌 用花粉从土壤中分离游动放线菌属 用蛇皮从土壤中分离小瓶菌属 用人的头发从土壤中分离角质菌属,生产菌种的来源,12,2.1.4 菌种的分离,2.1.4.1
4、 施加选择压力分离法 （富集培养法） 给混合菌株提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌株生长的条件，以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。,生产菌种的来源,13,（1）条件控制,营养成分的控制 pH值的控制 温度的控制 渗透压的控制 O2的控制 添加选择性抑制剂,生产菌种的来源,14,营养成分的控制 专一性碳源、氮源、生长因子的控制。 例:纤维素酶产生菌以纤维素为唯一碳源培养； 脂肪酶产生菌以植物油为唯一碳源培养； 降解石油/蜡菌以石油/蜡为唯一碳源培养。,生产菌种的来源,15,pH值的控制 控制增值培养的pH，抑制不需要的、对酸、碱敏感的微生物生长。 例：筛选碱性蛋白酶产生菌株： 在
5、pH=9.0的增殖培养基中培养，可抑制嗜酸或中性菌的生长，提高分离效率。,生产菌种的来源,16,温度的控制 控制培养的温度，仅适宜所需要的微生物生长。 例：高温（50-60）可得分解硬脂酸的脂肪酶产生菌； 低温（15 ）可得产不饱和脂肪酸的毛霉菌。 渗透压的控制 使用高糖或高盐培养基可得耐高渗菌株。,生产菌种的来源,17,O2的控制 控制培养过程的通风量以分离耗氧菌和 厌氧菌。 添加选择性抑制剂 在富集培养基中添加抑制非目的菌株生长的抑制剂。 例：在土壤悬浮液中加入10%的酚数滴，可抑制霉菌、细菌的生长以分离放线菌。,生产菌种的来源,18,（2）培养方法,分批式培养,将采集标本接入富集培养基中
6、,将富集培养物接入新的同样培养基中，重新建立选择压力,富集培养,接种至固体培养基,获得单菌落,重复转种几次,生产菌种的来源,19,恒化式培养（连续培养） 连续培养达到稳态时,S0, F, X0=0,S, F, X,S, V, X,稀释率D = F / V,通过改变基质浓度S（实际为改变F）可以控制不同菌的比生长速率，从而分离出所需要的菌种。,生产菌种的来源,20,S r时，AB B富集,S r时，AB A富集,生产菌种的来源,21,固体培养（透明圈法） 固体培养常用于富集各种酶的产生菌。,含有酶的作用底物的培养基,底物被菌落产生的酶水解而形成透明圈,涂布、培养,生产菌种的来源,22,2.1.4
7、.2 随机分离法,某些菌株的产物对其筛选没有直接的选择性指示作用，因而常采用随机分离法。,生产菌种的来源,23,（1） 抗生素产生菌的分离抑菌圈法,预先涂布试验菌的培养基,抗生素生长菌周围出现抑菌圈，而其他菌周围无抑菌圈,涂布、培养,生产菌种的来源,关键试验菌的选择,它直接影响： 检出的灵敏度 抗菌素的活性 抗菌谱,24,生产菌种的来源,在基本培养基（MM）上,野生菌（+） 产生长因子的突变株（+） 营养缺陷型菌株（-）,25,生长因子包括,氨基酸 核苷酸 维生素 等,（2） 生长因子产生菌的分离 生长圈法,26,涂布混合菌的平板,4冰箱保存,紫外线杀死原菌落，涂布营养缺陷型菌,生产因子产生菌
8、周围出现生长圈,影印,MM,CM,生产菌种的来源,MM,生长因子产生菌的分离 生长圈法,27,（3） 多糖产生菌的分离菌落形态法 多糖产生菌的菌落外观粘稠，容易分别。 （4） 酶抑制剂产生菌的分离酶靶法 O在待筛选菌培养液中加入靶酶,观察酶活性的变化,若酶活性降低,则此菌有可能产该酶抑制剂,生产菌种的来源,28,2.1.4.3 纯种分离,(1) 划线法,挑取菌种分区进行划线,培养,线的末端形成单菌落,生产菌种的来源,29,(2) 稀释法,将菌种逐次稀释,向平板中加入稀释倍数较高的菌悬液,涂布,培养,形成单菌落,单菌落逐一分别接种斜面, 摇瓶,测性能,生产菌种的来源,30,2.2 菌种的选育,原
9、理：依据微生物的代谢调节机制，人为的定向控制目的产物的积累。,自然选育,人工育种,31,2.2.1 自然选育,（1）定义 自然突变 在没有人工参与下微生物所发生的突变。 自然选育 在生产过程中不经过人工处理，利用微生物的自然突变而进行的菌种选育过程。,菌种的选育,32,多因素低剂量的诱变效应： 指由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期的综合效应。 诱变因素：宇宙射线、短波辐射、低剂量诱变物 质、H2O2,菌种的选育,（2）引起自然突变的原因,互变异构效应 DNA分子中碱基结构偶然发生的互变， 导致出现GT和AC碱基对，形成错配而发生基因突变。（10-8 10-9）,33,（3）自然突变的后果
10、 菌种退化，产量 质量 菌种稳定性 产量 （4）自然突变的应用 选育产量高、性能稳定的菌株,菌种的选育,34,挑取 单菌落,（5）自然选育的方法,发酵液,种子液,斜面,涂平板,培养,生产能力测试,挑选出更好的菌株,菌种的选育,35,2.2.2 人工育种,诱变,杂交,原生质体融合,转化,转导,基因工程,2.2.2.1 人工育种技术,菌种的选育,（1）诱变 利用物理或化学因素来处理微生物细胞群体，使其中少数细胞的基因发生改变。 （2）原生质体融合 通过人为的方法使两个不同遗传性状的细胞的原生质体融合，发生遗传信息的重组，产生具有双亲遗传性状的重组细胞。,菌种的选育,（3）转导 利用转导噬菌体为媒介
11、将部分供体基因转入受体细胞。 （4）转化 将较大的供体基因片段直接转入受体细胞发生重组。 （5）杂交 不同变种的细胞通过接合实现遗传物质的交换,菌种的选育,（6）基因工程 用人工方法将某种生物的基因提取出来，在离体条件下进行切割，再与载体DNA分子连接，然后导入某一受体细胞中使其进行复制、繁殖并得以表达。,38,菌种的选育,39,2.2.2.2 培养条件的优化,培养基的最佳配方：正交设计法 响应面法 环境条件： 温度 pH 装液量 摇床转数 2.2.2.3 菌种及产品性能的检测 菌种的遗传稳定性：反复接种培养 毒性测试：少量产品的理化性能、动物、临床实验,菌种的选育,40,（1）生产菌的基本特
12、征,2.2.2.4 工业性生产实验,菌种的选育,指扩大至中试车间或工厂小规模的生产试验。,菌种发酵能力和效率： 菌种应具有在较短的发酵周期内高效、快速地将原料转化为高纯度、高产量的发酵产物的能力。,副产物： 发酵中不产生或尽量少产生与目的产品性质相近的副产物及其它产物。 菌种的生长繁殖能力： 生长繁殖能力强，有较大的生长速率，产孢子能力强 。 营养要求： 菌种可利用的原料(培养基)来源丰富，价格低廉，且对原料成分的波动敏感度较小。,41,菌种的选育,环境条件： 培养条件粗放，菌种对设备和生产过程适应性强，抗污染能力强。 菌种的稳定性： 菌种的稳定性强，不易发生回复突变或质粒脱落。 菌种的耐渗透
13、压性能： 菌种能耐受高渗透压，即在较高底物、产物浓度下仍能正常生产。,42,菌种的选育,43,培养条件优化,逐级放大,连续稳定生产三批次,在线检测各种理化指标,（2) 工业性生产实验方法,菌种的选育,最佳生产条件的确定小试摇瓶,最佳配方： 由精料替换成粗料，碳源、氮源、无机盐、生长因子的配比进行微调。 培养： 接种方式，种龄，发酵周期。 通风量： 装液量为 25ml、50ml、100ml/250ml,44,菌种的选育,最佳生产条件的确定放大 逐级放大：摇瓶小罐大罐(500m3即500公吨) 通风量、搅拌速度、装液量、罐压、接种方式、种子级数、种龄、接种量、培养周期(种子、发酵)、温度、pH、泡沫等 连续稳定生产三批次以上。 在线检测所有相关理化数据。,45,菌种的选育,46,利用上述最佳培养方案，小规模地连续生产出少量产品，进行实质性的各项指标检测。 包括：理化指标、生产能力、毒性试验； 若为药品，则需要动物实验、临 床安全性试验 ,2.2.2.5 产品生产实验（中试）,菌种的选育,
