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1、第二章 基因工程的酶学基础（5学时）,常见的基因工程工具酶及其应用,1. 使核酸降解的核酸酶类： 2. 催化核酸合成的酶类： 3. 核酸修饰酶类；,核酸内切酶、核酸外切酶,DNA连接酶、 DNA聚合酶、逆转录酶、 RNA聚合酶,甲基化酶、激酶、基团转移酶、 磷酸酶等,第一节 限制性核酸内切酶,限制/修饰系统 (R-M, Restriction-modification system),B和K分别代表大肠杆菌的B和K菌株（引自Streips等, 2002）,一、寄主控制的限制与修饰机理 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修
2、饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。,一、寄主控制的限制与修饰的机理 限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。维护宿主遗传稳定的保护机制。,限制/修饰系统 (R-M，Restriction-modification system),各种细菌都能合成一种或几种能够切割双链DNA的内切核酸酶，以此来限制外源DNA的入侵,几乎所有的限制性内切核酸酶都和能识别、甲基化相同DNA位点的甲基转移酶（MTase）共同作用，一起构成限制-修饰系统。,寄主控制的限制与修饰的作用: 一是保护自身的DNA不受限制； 二是破坏外源DNA使
3、之迅速降解。 基因工程中，应采用 缺少限制作用的菌株作 为受体。,K12： rk+mk+ rk-mk- （用于转化实验） rk-mk+ （用于转化实验） rk+mk-（自杀型表型）,甲基化酶：甲基转移酶 Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基 Dcm甲基化酶 CCAGG或CCTGG 第二个C上C5位置上引入甲基,限制性内切核酸酶：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶 以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5端为磷酸基，3端为羟基。 1978 年，W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其
4、功能研究的突出贡献获得诺贝尔生物医学奖。,二、限制性内切核酸酶的类型 据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为、型三类。,基因工程中广泛使用,普遍采用的是Smith和Nathans（1973）提议的命名系统 由属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写），组成3个字母的略语组成酶的基本名称。 例如，大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示，流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,三、限制性内切核酸酶的命名,若该微生物有不同的变种或品系，再加上该变种或品系的第一个字母。如EcoRI，HindI； 如果某一种寄主
5、菌株，具有几个不同的限制修饰体系，则以罗马数字表示。 例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII。注意所有字母、数字不再使用斜体，字母与罗马数字之间不需要再留空格。 所有的限制性酶，除了以上规定外，前面还应带有系统的名称 如限制性内切核酸酶R. HindIII。 同样地，修饰酶则应在它的系统名称之前加上甲基转移酶（M）名称，如甲基转移酶M. HindIII。 在上下文已经十分清楚且只涉及REase的情况下，R可被省去,EcoR I,Escherichia,属名,Coli,种名,Ry13,株系,编号,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一
6、和第三个字母。,Escherichia coli RI Haemophilus influensae d Streptomyces achromagenes I （) ,EcoRI,Hind,SacI (II),REBASE 数据库 （http：/,四、II型限制核酸内切酶的基本特性,II型限制性核酸内切酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在。 由于其识别和切割DNA分子序列具有严格的特异性，因而是基因工程中广泛使用的工具酶 它们被誉为基因克隆的“分子剪刀” (molecular scissors)。,识别序列的特异性,1,切割位点的特异性,2,（一）识别序列的特异性 大多数II型限制性内切核
7、酸酶的识别序列长度为46bp，具有双重旋转对称结构的回文序列 如EcoRI的识别序列是：,5- GAATTC - 3 3- CTTAAG- 3,稀有限制酶： NotI GCGGCCGC 不严格专一限制酶：HindII-GTYRAC， （Y表示C或T，R表示A或G）,识别序列越长，位点出现的概率越小：,（1/4）n,但实际上未必所有的限制性核酸内切酶识别序列的出现概率都符合这样的规律。,具有6碱基识别序列的不同REase产生的片段，其平均大小可能与预计值4096 bp会有很大差异（表2-4）,（二）切割位点的特异性 1. DNA分子酶切片段的末端 依所用REase的不同，酶切后产生的片段末端，有
8、黏性末端和平末端等形式。,（1）黏性末端（sticky end） 黏性末端是指DNA分子在REase的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。 图2-2 EcoRI 产生的黏性末端及与其他来源互补黏性末端的退火连接,限制性内切核酸酶在识别序列的双侧进行切割，会产生两种形式的黏性末端： 若于对称轴的5末端切割，可产生5端突出的黏性末端，如EcoRI； 若于对称轴的3端切割，则产生3端突出的黏性末端，如PstI（图2-3）。,5黏性末端,3黏性末端,（2）平末端（blunt end）。若REase限制性酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片断末端
9、为平末端，如SmaI（图2-3）。,平末端,5突出的黏性末端,3 突出的黏性末端,平头末端,黏性末端的意义 连接便利 i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。,ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。, 5末端标记 凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进 行32P标记 凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个 多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端。 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐 末端。,2. 同裂酶与同尾酶 ：,SstI CCGC GG SacI CCGC GG,新裂酶,Kp
10、nI GGTAC C Asp718 G GTACC,可应用有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同，进行同样的切割，但可能产生不同的末端。,同裂酶: 能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶,KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC,Sau3A I BamH I GATC GGATCC CTAG CCTAGG,SauI Xho I G TCGAC CTCGAG CAGCTG GAGCT C,TCGA ? AGCT,C,G,G C,同尾酶（isocaudamer）：来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性末端，称为同尾酶。,利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大(相容性
11、末端); 同时，同尾酶产生的DNA片段能通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在分子克隆中有一定的作用; 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。 同尾酶可便于克隆载体的改造和构建，且可用于消除某些限制酶切点，但如果要回收重组克隆中的插入片段时，则要慎重选择适当的同尾酶。,五、影响限制性内切核酸酶活性的因素,DNA分子的构型,酶的星号活性,反应缓冲液,（一）酶的纯度 高质量的限制性内切核酸酶应是通过全面提纯的，不存在其他内切核酸酶或外切酶的污染 在长时间酶解时不出现识别序列特异性的下降 酶解的DNA片段连接
12、后能重新被识别和切割等。,（二）DNA样品的纯度 在采用不同的方法制备DNA样品过程中，会使样品含有残留氯仿、苯酚、乙醇、EDTA、SDS、盐离子等物质，或未去除干净的蛋白质或多糖的残留物，这些物质都可能影响REase的酶切反应活性。,条件受到限制，且必须在DNA纯度不高的情况下进行切割，可考虑采取以下措施提高酶活性 适当增加酶的用量 扩大反应体系体积 延长反应时间 添加阳离子亚精胺,（三）DNA的甲基化程度 原核生物细胞内存在限制-修饰系统，其中MTase甲基转移酶对DNA起修饰作用，从而使自身DNA不受体内限制性内切核酸酶的切割 甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 为了克服MTase
13、甲基转移酶的影响，在基因克隆中使用MTase缺失的菌株来制备质粒DNA。,（四）酶切反应的温度 消化DNA分子时，不同的REase具有不同的最适反应温度。 对于大多数限制性内切核酸酶，最适反应温度为37，但也有例外。 例如，SmaI、ApaI、BclI、MaeIII、TaqI的最适反应温度分别是25、30、50、是55、65。 酶切反应时低于或高于最适温度，都会影响酶的活性，甚至使酶失活。,（五）DNA分子的构型 底物DNA分子的构型会对限制性内切核酸酶的活性产生明显影响。 例如，对超螺旋质粒DNA或病毒DNA分子酶切时，所需要的酶量比对线性DNA分子酶切时所需要的酶量要高许多。,超螺旋质粒D
14、NA分子,线性DNA分子,（六）反应缓冲液 限制性内切核酸酶的反应缓冲液中包含有以下几种成分： 氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT）或-巯基乙醇、TrisHCl或TrisHAc。 多数酶切反应所需pH 7.07.6。缓冲液中-巯基乙醇或DTT可防止酶的氧化。 市售酶中都配有10倍的浓缩缓冲液，使用时只需加反应体系的1/10即可。,（七）酶的星号活性（star activity） 定义： 限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。 当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。 导致星号活性的原因主要有：高浓度的酶、高
15、浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等,六、限制性内切酶对DNA的不同消化作用的应用,DNA分子的双酶切消化,1,DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化,2,（一）DNA分子的双酶切消化 定义： 在分子克隆实验中，有时需要双酶切法，即用两种不同的REase切割同一种DNA分子，从而产生DNA分子片段带有两个不同的末端。 如果载体分子也用同样的两种酶切，这样就可以把外源DNA酶切片段定向地插入到载体分子中。,（二）DNA分子的完全酶切消化和部分酶切消化 完全酶切消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 部分酶切消化：内切酶在DNA上的所有位点只有部分被切开。 在实验中，通常通过缩短酶切消化的
16、反应时间或降低反应温度以约束酶的活性以达到部分消化的目的。,DNA分子的完全酶切消化（a）和部分酶切消化（b）,七、限制性核酸内切酶的应用： 重组前DNA的切割 构建新载体 构建物理图谱,第二节 DNA连接酶,第二节 DNA连接酶,剪刀- 限制性内切酶 针线、胶水- 连接酶,概念：DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种能够催化双链DNA上彼此相邻的3-羟基（OH）和5-磷酸基团（-P），在NAD+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键。该过程为吸能反应过程。 连接反应的特点： 一条DNA链的3末端具有游离的羟基（-OH），而另一条DNA链的5末端具有游离的磷酸基团（-P）； 连接需要ATP或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活
