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1、南方医科大学2 0 0 9 级硕士学位论文 食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌L A M P 快速检 测技术的建立与初步应用 E s t a b l i s h m e n ta n da p p l i c a t i o no f L A M Pm e t h o df o rr a p i dd e t e c t i o no f t w of o o d - b o r n ep a t h o g e n s 课题来源：广东省科技计划项目：2 0 0 9 8 0 3 0 8 0 3 0 4 0 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 病原生物学 曾桂芬 龙北
2、国教授 江丽芳教授 周荣教授 彭涛教授 黎诚耀教授 芮勇宇教授 论文评阅人吴清平教授 陈清教授 2 0 1 2 年5 月1 5 日广州 碰士学住论文 食源性致病菌阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌 L A M P 快速检测技术的建立与初步应用 一、研究背景和目的 硕士研究生：曾桂芬 指导教师：龙北国教授 摘要 近年来，随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫 生热点。食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，对人类健康造成极大危 害，是食品安全的重大隐患。随着经济发展和技术进步，食源性疾病并未减少 或消失，世界范围内食品安全恶性事件反而接连发生，食品安全形势严峻。目前， 食源性致病菌的检测存
3、在特异性差、操作繁琐、耗时，以及不能现场应用等问 题。本研究旨在建立阪崎肠杆菌( E m e r o b a c t e r S a k a z a k i i ) 和痢疾志贺苗( 砌胖，口 d y s e n t e r i a e ) 两种常见食源性致病菌的快速检测方法。 阪崎肠杆菌是一种重要的食源性致病菌，呈世界性分布，主要通过晏幼儿 配方奶粉经消化道感染儿童引起新生儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎甚 或遗留神经系统后遗症或导致死亡。目前引起阪崎肠杆菌感染事件的发生规 模呈明显上升趋势，已成为我国重要的食源性致病菌。国际食品微生物标准委 摘要 地会十2 0 0 2 年将贩崎肠杆茼列为对特定
4、人群产生f “重的7 命危害或产生慢性后 遗症的微生物。陶家质检总局于2 0 0 5 年8 j 颁布了检测阪崎肠杆菌的行业标准 S N T 1 6 3 2l 。2 0 0 6 年，针对婴幼儿配方乳粉受阪崎肠杆菌污染的高风险性和污 染后的巨大危害性，国家质检总局颁布了婴幼儿配方乳粉中阪崎肠杆菌每批必 检的市场准入要求。检测阪崎肠杆苗的传统方法步骤繁琐，一般须耗时6 d 左右， 近年来圜内外相继建立了E L I S A 、P C R 、核酸杂交等检测技术。 痢疾志贺菌是人和动物肠道内寄生的革兰阴性无芽胞杆茁，是一类具有较 强传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌，所致的细苗性痢疾( S h i g
5、e l l o s i s ) 是世界上尤其是发展中国家重要的传染病之一，全球每年细菌性痢疾病倒高达 l6 5 亿，其巾16 3 亿发生在发展中国家，并导致1 1 0 万患者死1 、：，其巾6 0 以 上为5 岁以下儿童。近年来，痢疾志贺苗食物中毒的发生规模呈明显上升趋势， 成为我国首要的食源性致病菌之一。目前，我国常用的志韬氏蔺的检验方法主 要是国标法( G B T 4 7 8 95 2 0 0 3 ) 。整个检测程序需要3 5 d 完成，检测时间长， 检出限为1 0 4 C F U m L 。免疫学方法简单，但灵敏度不高；P C R 方法具有灵敏、 快速等优点，但检测成本较高，仪器昂贵，1
6、 ：适于基层单位推广出H j 。 综上，建立准确、灵敏、操作简便、不依赖昂贵仪器的榆测方法对于食源 性致病菌感染的诊断、疾病控制和流行病学调查具有重要意义：发展快速准确、 操作简便的检测与鉴定阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌的方法成为相关研究的热点。 目前，常用快速检测方法主要有E L I S A 、D N A 探针、常规P C R 、R e a l - t i m eP C R 等。环介导等温扩增技术( 1 0 0 p m e d i a t e di s o t h e r m a la m p l i f i c a t i o n ，L A M P ) 是一 种新颖的核酸扩增技术，依赖于能够识别
7、靶D N A 上6 个特定区域的4 条引物和一 种具有链置换活性的D N A 聚合酶，在恒温条件F 高效扩增核酸，具有高特异性、 快速、灵敏、操作简便等特点。自从2 0 0 0 年以来，L A M P 技术在临床疾病的诊断、 枘坛细m 或j “n ，性枪删以及动物胍】f i 性刖络定等山向心川泛。L A M P 技术在困内起步较晚，应用L A M P 技术检测阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌在国内外文 献巾报道较少。 I l 硕士学位论工 本研究针对阪崎肠杆菌外膜蛋白O m p A 基因和痢疾志贺茵i p a H 基因，分别设 计相应的L A M P 引物，建立优化的反应体系，考察特异性和灵敏度，并应用
8、于食 品样品的直接检测，初步建立阪崎肠杆菌和痢疾志贺菌的L A M P 检测方法。 二、研究方法 1 阪崎肠杆菌L A M P 快速检测技术的建立与初步应用 ( 1 ) 阪崎肠杆菌L A M P 检测技术的建立 根据G e n B a n k 公布的阪崎肠杆菌外膜蛋白O m p A 基因序列( A c c e s s i o n n u m b e r ：D Q 0 0 0 2 0 6 ) 的保守区，利用L A M P 专用软件P r i m e r E x p l o r e rv e r s i o n4 设计一套特异性引物，即外引物F 3 和B 3 、内引物B I P 和P I P 。以
9、阪崎肠杆菌 ( A T C C 2 9 5 4 4 ) 提取的D N A 为模板，建立检测阪崎肠杆菌的L A M P 检测技术 体系，并对反应体系内各反应条件进行优化，最终摸索出优化后检测阪崎肠杆 菌的L A M P 反应体系。 ( 2 ) 阪崎肠杆菌L A M P 灵敏度、特异性实验和实际样品检测 利用建屯的L A M P 方法检测阪崎肠杆菌纯培养物，考察其灵敏度。将过夜 培养的阪崎肠杆菌( A T C C 2 9 5 4 4 ) 苗液1 0 倍倍比稀释至1 0 。1 0 一，取各稀释 度菌液1 0 0 u l 进行平板计数。同时取各稀释度茼液l m l 提取D N A ，取2 u l 上清
10、 液作为模扳进行L A M P 扩增和P C R 扩增，测试两种方法检测阪崎肠杆菌纯培 养物的灵敏度。 选取3 株阪崎肠杆菌标准菌株和大肠埃希菌、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球 菌等1 2 株其它非阪崎肠杆荫致病菌进 f 特异性实验，检测L A M P 方法的特异性。 依据本实验所建立的L A M P 和P C R 的条件和参数，对3 6 份奶粉样品进行检测， 并与F D A 检测方法进行比较。 2 痢疾志贺菌L A M P 快速检测技术的建立与初步应用 ( 1 ) 痢疾志贺茵L A M P 检测技术的建立 根据G e n B a n k 公布的痢疾志贺茵i p a H 基因序列( A c c e
11、s s i o nn u m b e r ： 摘要 M 7 6 4 4 5 ) ；1 的保 区作为靶序列，设训荆疾志贺菌特异性引物，包括外。l 物I ? 3 和B 3 、内引物B I P 和F I P 、环引物L F 和L B 。以痢疾志贺苗( C M C C 4 8 0 9 7 ) 提 取的D N A 为模板，建盘检测猁疾志贺菌的L A M P 检测技术，并对反应体系内 荇反应条件进彳优化。最终得 优化后检测痢疾志贺菌的L A M P 反应体系。 ( 2 ) 痢疾志贺菌灵敏度、特异性实验和实际样品检测 聚用建立的L A M P 疗法检测痢疾志贺茼纯培养液，考察其灵敏度。将过夜 培养的痢疾志贺
12、茼( C M C C 4 8 0 9 7 ) 菌液1 0 倍倍比稀释罕1 0 - 1 1 08 ，取各稀释 度菌液1 0 0 u l 进行平板计数。同时取各稀释度茼液l m l 提取D N A ，取2 山上清 液作为模板进行L A M P 扩增和P C R 扩增，测试两种方法检测荆疚志贺荫纯培 养物灵敏度。 同时选取4 株志贺菌标准菌株和大肠埃希苗、伤寒沙门菌、金黄色葡萄球 菌等其它非志赞苗进行特异性实验，榆删L A M P 方法的特异性，纠步应用于人 工污染猪肉样品痢疾志贺菌的检测，并j 常规P C R 方法比较。 三、结果 1 确定阪崎肠杆苗L A M P 优化反应体系为：6 m MM g
13、 C 2 o6 m M d N T P s ， o8 Mb e t a i n e ，o4 p M 外引物( F 3 和B 3 ) 16 9 M 内引物( P I P 和B I P ) ，8 U 的B s tD N A 聚合酶，25 9 lY h e r m o p o lb u f f e r ，2 p LD N A 模板，d d H 2 0 补足体积 至2 5 I ；扩增温度5 8 “ C ，反应6 0 m i n ，产物于2 琼脂糖凝胶屯泳分析，得到典 型的L A M P 梯形条带，肉眼观察反应副产物焦磷酸镁白色沉淀。 L A M P 法能检出所有的阪崎肠杆菌菌株，产生特异性扩增的梯形条
14、带，直 接用肉眼观察到焦磷酸镁白色沉淀，而其它肠道致病菌均未产生特异扩增的梯 形条带。L A M P 对阪崎肠杆菌纯菌液检测灵敏度为20x 1 0 c f u m L ，P C R 检测灵 敏艘为20 叫0 1c f u m 1 L A M I ，榆删们尤敞艘址1 统P C R 疋敞艘的1 0f 榆测 时间缩短r2 3 h 。采川L A M P 法检测3 6 份奶粉样晶，J t ，2 份样t 仙榆 j 阪崎 肠杆菌，阳性率为56 ，与F D A 方法检测结果一致。 硕士学位论五 2 确定痢疾志贺苗的L A M P 反应体系为：5 m MM g C l 2 ，03 m Md N T P s ，0
15、6 M b e t a i n e ，04 u M 外引物( F 3 和B 3 ) ，16 M 内引物( F I P 和B I P ) 与l6 “M 环 引物( L F 和L B ) ，8 U B s t D N A 聚合酶大片段，T b e r m o P o lb u f f e r 25 9 l ，D N A 模板2 a l ，d d H 2 0 补足体积至2 5 k t l ：扩增温度6 3 “ C 反应6 0 m i n ，产物于25 琼 脂糖凝胶电泳分析，得到典型的L A M P 梯形条带。 L A M P 法能检出4 株志贺菌，产生特异扩增的梯形条带，其余肠道致病菌均 未产生特异
16、扩增的梯形条带，表明选用的志贺i p a H 基因引物的特异性强。 L A M P 法对痢疾志贺菌纯菌液检测灵敏度为53 1 0 1 c f u m l ，对人工污染的猪肉样 品的痢疾志贺菌检测限为68 1 0 1 c f u m l 。P C R 检测的灵敏度为53 1 0 2 c f u m l ，猪 肉样品为68 1 0 2 c f u m L ，L A M P 的灵敏度均比传统P c R 灵敏度高l O 倍，整个检测 过程可在2 h 内完成。 四、结论 本研究建立了乳制品中阪崎肠杆菌、肉制品中痢疾志贺苗的L A M P 快速检 测技术，井在实际样品检测中得到了初步应用。L A M P 检测技术针对靶基因的6 个区域设计4 条( 6 条) 特异引物，特异性强；L A M P 检测限为1 0 。c f i g m L ，是 P C R 法灵敏度的1 0 倍。L A M P 法能直接对奶粉、肉制品、乳制品等食品中的 致病菌进行检测，实际样品一般在2 0
