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1、第10章 酶促反应动力学 影响酶促反应速度的因素 kinetics of enzymecatalyzed reactions,酶促反应的动力学,酶促反应速度的测定与酶的活力单位,1 酶促反应速度的测定,2 酶活力的测定,酶活力的表示方法,每毫克蛋白所含酶的活力单位数,（常常作为酶制剂纯度的指标）,每秒钟、每个酶分子转换底物的umol数,影响酶反应速度的因素,2、底物浓度 3、pH （最适 pH的概念） 4、 温度 （最适温度的概念） 5、激活剂 6、抑制剂,1、酶浓度,当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=kE,二、底物浓度对酶反应速度的影响,1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线 （Mi
2、chaelisMenten曲线） 2、米氏方程的提出及推导 3、米氏常数的意义 4、米氏常数的测定,1、酶反应速度与底物浓度的关系曲线,酶促反应速度的测定,底物浓度对酶促反应速度的影响,1、当底物浓度较低时，表现为一级反应（v=dc/dt=kc 线性关系） 2、随着底物浓度的增加，反应表现为混合级反应。 3、当底物浓度达到相当高时，表现为零级反应（与底物浓度无关）。,根据以上实验结果，Henri和Wurtz提出了酶底物中间络合物学说。即,酶和底物形成中间复合物的学说已得到许多实验证明。,2、单分子酶促反应的米氏方程及Km,推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照“稳态平衡”假说的设想进行推导。
3、,假定： 1、ES稳态(浓度保持不变的状态) 2、底物E 3、ES分解成产物的逆反应忽略不记,米氏方程的推导,则：,1,k,ES,S,ES,S,E,t,=,-,k2 + k3,ES生成速度： V1=K1( Et-ES) S,ES分解速度： V2=K2ES+K3ES,即：K1(Et-ES)S=K2ES+K3ES,当酶反应体系处于恒态时：V1 = V2,将（4）代入（3）则：,将（1）代入（2）得：,(3),当Et=ES时，,所以,酶促反应速度由ES决定，即,（2）,(4),米氏方程:,米氏常数:,3、Km值（米氏常数）的意义（重点）,（1）Km的物理意义：当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底
4、物浓度。,（2） Km是酶的特征常数之一，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。,（3）如果一种酶有几种底物，则对每一种底物，各有一个特定的Km值，其中Km最小的称为该酶的最适底物或天然底物。 Km还受PH及温度的影响，因此Km作为常数只是针对一定的底物、一定PH、一定温度而言。测定的Km值可以作为鉴别酶的手段，但是必须在指定的实验条件下进行。,Km = (k2+k3) / k1,（4） 判断反应速率v和Vmax之间的关系： 若已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度时，其反应速率v相当于Vmax的百分率。或计算任何v下的s。（用Km的倍数表示）。,练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L
5、-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80时底物的浓度应为多少？,（5）、 Km值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径，这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。 催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的Km值往往是不同的，测定这些Km值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率。,Vmax的意义,在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。 pH、温度和离子强度等因素也影响Vmax的数值， 同一种酶对不同底物的Vmax也不同。,转换数的定义,当底物浓度很高时，Vmax = k3ES = k3E，k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子
6、转换底物的分子数，这个常数又叫做转换数(简称TN)，又称为催化常数(catalytic constant，kcat)。 kcat值越大，表示酶的催化效率越高。,主要利用作图法测定,S,v,Km,4、 米氏常数的测定,(1) 测定不同底物浓度的反应初速率，以v-S作图，可以得到Vmax，再从1/2 Vmax，可求得相应的S，即Km值。,(2) 双倒数作图法,斜率=Km/Vmax,将米氏方程式两侧取双倒数，以1/v-1/s作图，得出一直线.,将左式两边均乘以S得：以s/ vs作图，得一直线，横轴的截距为-Km，斜率为1/ Vmax,(3) HanesWoolf作图法,三、pH对酶反应速度的影响,p
7、H影响酶活力的原因：,(1) 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。 (2) 当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。 影响了底物的解离状态；影响酶分子活性部位上有关基团的解离；影响到中间络合物ES的解离状态，不利于催化生成产物。 (3)影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响酶活性部位的构象。,四、温度与酶反应速度的关系, 在达到最适温度以前，反应速度随温度升高而加快 酶是蛋白质，其变性速度亦随温度上升而加快 酶的最适温度不是一个固定不变的常数,v,温度,温度对酶反应的影响,最适温度,机理：温度导致酶蛋白变性,温度对酶反应的影响,在最适温度之前，一般
8、温度越高，反应速度就越快。 Q10（温度系数）：反应温度提高10，其反应速率与原来反应速率之比，对大多数酶来讲，温度系数Q10多为2， 酶的固体状态比在溶液中对温度的耐受力要高。通常酶制剂以固体保存为佳。,五、激活剂对反应速度的影响,激活剂：能提高酶活性的物质,2 中等大小的有机分子：,辅助因子；可能与酶分子肽链上侧链基团结合，稳定酶分子活性构象；生成螯合物，在酶和底物间起桥梁作用,还原剂:Cys、GSH 金属螯合剂：EDTA,3 具有蛋白质性质的生物大分子 （酶原的激活） 一些蛋白酶,1. 激活剂(activator),激活剂：凡是能提高酶活性的物质。其中大部分是无机离子或简单有机化合物。
9、金属离子有K+、Na+、Ca2+、Mg2+等离子，如Mg2+是多数激酶及合成酶的激活剂， 无机阴离子如：Cl、Br、I等都可作为激活剂。如Cl是唾液淀粉酶的激活剂 简单的有机化合物：Cys对某些含巯基的酶有激活作用,2. 激活剂对酶作用的特点,（1）激活剂对酶的作用具有一定的选择性 ；即一种激活剂对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能起抑制作用 （2）有时金属离子之间也可相互替代 （3）激活离子对于同一种酶，可因浓度不同而起不同的作用，低浓度激活，高浓度抑制,六、抑制剂对酶促反应速度 的影响（重点）,抑制剂（inhibitor） :使酶的必需基因或酶的活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚
10、至使酶完全丧失活性的物质。 抑制作用(inhibition) :酶的必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失 。有选择性。 失活作用(inactivation) :使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用 ,变性剂对酶的变性作用无选择性.,抑制剂；抑制作用；失活作用,抑制与失活之间关系的总结,1、抑制作用的类型,根据抑制作用是否可逆: 1、不可逆的抑制作用: 抑制剂与酶的必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用. 2、可逆的抑制作用: 抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是可逆
11、的,v,E,1,2,非专一性不可逆抑制剂,抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。,类型：,实例：有机磷杀虫剂,-Ser-OH,专一性不可逆抑制剂,这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 亲和标记试剂：具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有一个活泼化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性，因抑制是利用酶对底物的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称之。,自杀性底物： 不但具有天然底物的类似结构，而且也是酶的底物，但它还有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反
12、应基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，这类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂，故把这种抑制剂称为自杀性底物。,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,竞争性抑制（competitive inhibition）,抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争性地与酶活性中心结合,非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）,酶可以同时与底物与抑制剂结合,反竞争性抑制: 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合,竞争性非竞争性抑制作用机理示意图,2、可逆抑制作用的动力学（重点）,（1）竞争性抑制的动力学特征,竞争性抑制（competitive in
13、hibition）,抑制剂化学结构与底物相似，因而与底物竞争性地与酶活性中心结合,（1）V下降，发生抑制,（2） Vmax不变（底物浓度增大，抑制剂结合机率减小）,（3） Km增大，亲和力下降,（2）非竞争性抑制的动力学特征,非竞争性抑制（noncompetitive inhibition）,酶可以同时与底物与抑制剂结合,（1）V下降，发生抑制 （2） Vmax减小（一部分酶始终失活） （3） Km不变，酶与底物亲和力不受影响,（3）反竞争性抑制的动力学特征,反竞争性抑制: 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合,介绍：酶的抑制作用在工、农业及医学上的应用,四、一些重要的抑制剂,抑制剂: 使酶活性降低的物质。 抑制剂作用分可逆抑制剂与不可逆抑制剂 可逆的依据：能否用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，使酶复活 机理：实际上是底物的类似物，专一地作用于某一种酶活性部位的必需基团而导致酶的失活，,
