固定化葡萄糖氧化酶生产葡萄糖酸钠研究

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1、山东轻工业学院 硕士学位论文 固定化葡萄糖氧化酶生产葡萄糖酸钠的研究 姓名：张岳勋 申请学位级别：硕士 专业：发酵工程 指导教师：王瑞明 2011-06-15 山东轻工业学院硕士学位论文 I 摘 要 摘 要 本论文利用酶法生产葡萄糖酸钠，研究内容包括葡萄糖氧化酶提取条件的确 定、固定化葡萄糖氧化酶的制备、固定化酶性质的研究、固定化酶生产葡萄糖酸 钠的工艺条件研究。 本文以产葡萄糖酸钠黑曲霉废菌丝为原料提取葡萄糖氧化酶。由于葡萄糖氧 化酶是胞内酶，需要先将菌丝破壁，使其中的葡萄糖氧化酶释放出来，而且要采 取措施保证酶的活力损失最小。获得的粗酶液，再经过初步纯化，即可制成酶制 剂。确定了破壁的方法

2、为超声破壁，超声破壁的最优条件为：超声时间 50min，超 声温度 60，超声功率 200W。破壁后选取 70%乙醇一次沉淀葡萄糖氧化酶，然 后用 16%的 PEG 二次沉淀酶。 本研究首先对三种固定化载体的固定化效果进行考察，通过比较三种固定化 酶的制作难易程度、酶活回收率，最终选取了羟基磷灰石作为载体。确定了最佳 固定化最优条件为：给酶量为 0.07g/mL，温度为 30，pH 6.5，固定时间 15h。 利用新型纳米材料羟基磷灰石固定化葡萄糖氧化酶，研究了固定化酶的酶学 性质。研究了温度、pH、金属离子、储存时间对游离酶和固定化酶活力的影响。 固定化酶的最适反应温度 40， 最适 pH

3、值为 6.5， 较游离酶分别提高了 4和 0.9。 固定化酶的平均酶活回收率为 61.85%。此外， 固定化后的酶储存稳定性有所提高， 可重复使用七次，酶剩余活力仍在 62.1%。 本文对底物浓度、温度、pH、通气量与反应时间等因素对酶法生产葡萄糖酸 钠工艺进行了优化。结果表明：底物浓度对糖酸物质的量转化率影响不显著，最 适温度40，最适pH 6.5，通气量10L/min，反应时间80h。正交试验对葡萄糖 酸钠制取工艺优化，最优结果为：底物浓度 400g/L，温度 40，pH 6.5，通气量 10L/min，反应时间 80h。 关键词：关键词：葡萄糖酸钠；葡萄糖氧化酶；提取；固定化；酶学性质；

4、工艺 山东轻工业学院硕士学位论文 I ABSTRACT This thesis is based on production of sodium gluconate with enzyme.The main research contents include the determination of GODs extraction conditions, preparation of immobilization of GOD, properties of immobilized enzyme, process conditions of sodium gluconate production

5、 by immobilized enzyme. In this paper, waste mycelium of sodium gluconates production is used in the extraction of GOD. As GOD is intracellular enzyme, first mycelium need to be broken, then glucose oxidase can be released from intracellular, at the same time I should take steps to ensure minimal lo

6、ss of enzyme activity. After the initial enzyme solution is obtained, it is futher to be purificated and be made into enzymes. Finally the method of waste mycelia broken can be determined, the optimal conditions are: ultrasonic time is 50min, ultrasound temperatures is 60, the ultrasonic power is 20

7、0W. After waste mycelia is broken, 65% ethanol is used to precipite GOD, and then 16% PEG is used to precipite GOD for the second time. The effects of three carriers for enzyme immobilization were firstly researched, by comparing ease of production of the three immobilized enzyme and activity recove

8、ry, at last hydroxyapatite is selected as a carrier. The optimum conditions for immobilization is: the amount of enzyme was 0.07g/mL, temperature 30, pH6.5, fixed time 15h. GOD is immobilized with a new nano-materials Hydroxyapatite, then study the enzymatic properties of immobilized enzyme. The eff

9、ects of temperature, pH, metal ions, storage time on the free enzyme and immobilized enzyme activity are researched . The optimum temperature and pH of immobilized enzyme is 40 and 6.5, increased by 4 and 0.9 compared with free enzyme. The average enzyme activity recovery of the immobilized enzyme w

10、as 61.32%. In addition, storage stability of the immobilized enzyme is increased. It can be reused for seven times, the remaining enzyme activity was still 62.1%。 In this paper, the enzymatic production of sodium gluconate on substrate concentration, temperature, pH, aeration rate and reaction time

11、was optimized. The results showed that: substrate concentration have little effect conversion on the amount of sugar and acid substances;optimum temperature is 40, optimum pH is 6.5, ventilation is 10L/min, reaction time is 80h. Orthogonal Preparation of sodium gluconate process optimization, optima

12、l results are: substrate concentration is 400g/L, ABSTRACT II temperature is 40, pH is 6.5, ventilation is 10L/min, reaction time is 80h. Keywords: sodium gluconate, GOD, extract, immobilized, enzymatic property, technology 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律

13、意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日

14、期： 年 月 日 山东轻工业学院硕士学位论文 1 第 1 章 绪论 1.1 引言 目前全世界主要使用四种方法来生产葡萄糖酸钠，分别为生物发酵法、均相 化学氧化法、电解氧化法和多相催化氧化法，这四种方法在中国均有着广泛的研 究 1，应用于工业生产的主要为生物发酵法和均相化学氧化法，近几年生物发酵 法的应用越来越广泛。 生物发酵法生产葡萄糖酸钠使用的菌种大多是黑曲霉，该方法是在 240 300g/L 的葡萄糖溶液中加入少量的硫酸镁、玉米浆等营养物质，经过 121灭菌 20min 后，待培养基冷却，接种体积分数为 10%的种子液，同时开动搅拌和通气， 发酵温度维持在 35，pH 为 6.5 左右，p

15、H 通过流加 NaOH 来调节。当残糖降至 1g/L 时可以认为发酵结束。发酵液经过过滤、真空浓缩、结晶、喷雾干燥后可得 葡萄糖酸钠粉状产品。发酵法生产葡萄糖酸钠具有发酵速度快、发酵过程易于控 制、产品易提取等优点，但同时也有一定缺陷，如产品色泽不易控制等。 多相催化氧化法是在 60以下，通过催化剂的反复催化使用来制备葡萄糖酸 钠。该方法的优点是反应时间短、转化率高、工艺过程简单、三废少且易处理等， 但由于贵金属价格昂贵和催化剂易失活，只要能克服这两个缺点，同样拥有较大 的优越性和应用潜力。 20世纪80年代起，许多学者开始研究使用固定化酶法生产葡萄糖酸钠，其中 包括固定化细胞和固定化酶，但都

16、遇到同样难以解决的问题，即反应过程中耗氧 量极大，传氧速率慢。许多学者预计：今后生产葡萄糖酸钠的方法极有可能朝着 固定化细胞或固定化酶的方向发展 2。 1.2 葡萄糖酸钠的用途 葡萄糖酸钠(sodium gluconate)，又称五羟基己酸钠，是一种用途极为广泛的多 羟基有机酸盐，它的性质是易溶于水，在醇中溶解度略低，完全不溶于醚。其分 子式为 C6H11NaO7，相对分子质量为 218.143。在建筑工业、食品、水质稳定剂、 钢铁表面清洗剂、医药、玻璃瓶专用清洗剂等方面有着广泛的用途。 1.2.1 建筑工业 随着我国城市化进程的加快，混凝土利用率越来越高，相对于其他化工原料， 如木质素衍生物与烷基芳香磺酸盐、顺丁烯二酸衍生共聚物、芳香族氨基磺酸系 第 1 章 绪论 2 高分子化合物等，葡萄糖酸钠在减水缓凝效果上具有明显的优势4。 由于葡萄糖酸钠在结构上只有一个羧基，是多羧酸系高性能减水剂中的一类， 其减水率、含气量