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1、DNA甲基化动态：发生、保持和去甲基化一、甲基化DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5-端的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。中文名甲基化检测外文名detection of methylation目录1. 1甲基化检测2. 2检测程序3. 3送样要求甲基化检测编辑DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5-端的胞嘧啶转变为5-甲基胞
2、嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。检测程序编辑1甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基
3、化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。2亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。3高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）在非CpG岛位置设计一对
4、针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。在动物中，DNA甲基化主要发生在CG二核苷酸背景下，由从头甲基化转移酶(de novo methyltransferases)中的DNA 甲基化转移酶3(Dnmt3)家族催化发生，由保持甲基化转移酶Dnmt1催化保持。而在植物中，DNA甲基化可以发生在各种背景下的C碱基上，包括CG、CHG(H=A、T或C)以及CHH，以CG为主。CG甲基化主要
5、发生在gene body区，而CHG和CHH甲基化主要发生在转座子区域以及重复序列区，从头甲基化均由Dnmt3的同源酶DRM2催化发生，但是保持却因背景不同而各异。CG由Dnmt1的同源酶MET1催化保持，CHG由CMT3催化保持，而CHH依旧由从头甲基化酶DRM2催化保持。在植物中，RNA介导的甲基化(RNA-directed DNA methylatio, RdDM)能够识别各种背景下的胞嘧啶，使其发生甲基化从而调控基因的表达。与转座子和重复元件相关的单链RNA(ss RNA)被认为可能是由聚合酶IV(Pol IV)转录生成，之后在RDR2 (RNA-dependent RNA polym
6、erase)作用下生成双链RNA(ds RNA)，再由DCL3(一种类Dicer蛋白)切割形成24nt的siRNA，之后蛋白质AGO4(argonaute)与RNA-RNA或RNA-DNA交互作用, 可能导致依赖RNA 的DNA甲基化酶DRM2 催化C的从头甲基化, 并通过 CMT3、MET1 和DRM2维持其甲基化。对拟南芥的研究发现，在种子发育过程中，胚乳中往往会发生广泛的去甲基化，而胚却发生高甲基化。在雄配子形成时营养核(vegetative nucleus) 中转座子和重复元件被重新激活，产生大量相关的siRNA，通过未知途径进入精子细胞中，通过RdDM通路加强精子中转座子和重复元件的
7、沉默。在雌配子形成时中心细胞中发生广泛的去甲基化，转座子和重复元件被激活，大量相关的siRNA由此产生，这些siRNA通过未知途径进入卵子细胞中加强其中转座子和重复元件的沉默。而在双受精过程中一个精子与二倍体中心细胞结合发育成胚乳，可见胚乳中观察到的低甲基化来源于中心细胞的去甲基化。而另一个精子与卵细胞结合发育形成胚。动物DNA甲基化主要发生在胚胎发育早期，大约在着床期就已经形成。与植物不同，在动物中是由piRNA和PIWI蛋白(在动物高度保守的argonaute蛋白)复合介导Dnmt3a和Dnmt3b催化C的从头甲基化。DNA甲基化谱式是在胚胎发育过程中逐步建立起来的，不同组织类型的细胞具有
8、不同的甲基化谱式。另外，组蛋白修饰在调控从头DNA甲基化发生过程中也发挥的重要作用。有研究表明，Dnmt3L能与未发生甲基化的H3K4尾巴相互作用，从而可能募集Dnmt3a与之形成四聚体(包括2个Dnmt3a和2个Dnmt3L)，导致特定位点(如印记基因)的从头甲基化。在2011年，中科院上海生命科学研究院生化与细胞所徐国良研究组在研究起始性DNA甲基化发生机制方面的新进展。他们在对小鼠进行研究时发现，未发生甲基化的H3K4尾巴能被从头DNA甲基转移酶Dnmt3a通过其PHD结构域特异性地识别并结合，从而将其募集到特定位点导致该位点的从头甲基化，而发生甲基化的H3K4则会阻碍了这种特异性地结合
9、。DNA去甲基化分为两类：主动去甲基化（Active DNA Demethylation）和被动去甲基化（Passive DNA Demethylation）。基因组甲基化模式的形成主要依赖于主动去甲基化，主要涉及一类具有DNA去甲基化功能的蛋白，可能存在的五种机制a. DNA转葡糖基酶参与的碱基切除修复（base excision repair；BER）：5-mC 由DNA 转葡糖基酶直接去除。此途径主要存在于植物体内，动物体内也可能存在。b.脱氨酶参与的碱基切除修复：5-mC 脱氨变成胸腺嘧啶T，形成G/T 错配，进入BER 途径。这一途径主要存在于动物体中，植物体中也可能存在。c.核苷酸
10、外切修复机制（nucleotide excision repair；NER）：直接移除甲基化的CpG 二核苷酸。d.氧化去甲基化：发生氧化反应打开碳-碳键，直接去除甲基基团。e.水解去甲基化：水解胞嘧啶的甲基基团，使其以甲醇的形式被释放。DNA被动去甲基化是指当DNMTs活性被抑制或浓度过低时，无法维持原有的甲基化状态，使DNA甲基化程度降低的过程，这类去甲基化通常发生在细胞复制的两个周期之间，涉及到某些可与DNMTs结合的因子，其结合后形成的复合物可以阻止DNMTs与DNA的结合。DNA甲基化通过发生、保持和去甲基化是DNA甲基化谱处于精确的平衡状态，DNA甲基化谱式的紊乱在动物中可能导致胚
11、胎死亡、多种神经退行性疾病以及癌症的发生，在植物中会导致多种形态的缺陷。所以，对DNA甲基化动态研究具有重要的意义。DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet家族的双加氧酶进一步氧化为第7种碱基：5-羧基胞嘧啶（5caC）；此外，胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）可以特异性地识别这一新的碱基修饰形式，并将其从基因组中切除。DNA甲基化编辑DNA甲基化（DNA methylation）是最早发现的修饰途径之一，大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。中文名DNA甲基化外文名DNA methylation影响控制基因表达
12、甲基酶分类DNM T1、DNM T3a、DNM T3b去甲基化途径被动途径和主动途径作用修饰DNA序列目录1. 1含义2. 2结构基因3. 3酶的分类4. 4去甲基化含义编辑在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5甲基胞嘧啶，这常见于基因的5-CG-3序列。大多数脊椎动物基因组DNA都有少量的甲基化胞嘧啶，主要集中在基因5端的非编码区，并成簇存在。甲基化位点可随DNA的复制而遗传，因为DNA复制后，甲基化酶可将新合成的未甲基化的位点进行甲基化。DNA的甲基化可引起基因的失活，DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，从而影响了蛋白质与DNA的相互作用，甲基化
13、达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡，由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始，导致基因失活。另外，序列特异性甲基化结合蛋白（MBD/MeCP）可与启动子区的甲基化CpG岛结合，阻止转录因子与启动子作用，从而阻抑基因转录过程。DNA甲基化主要形成5甲基胞嘧啶（5-mC）和少量的N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7甲基鸟嘌呤（7-mG）1结构基因编辑含有很多CpG 结构，2CpG 和2GPC 中两个胞嘧啶的5 位碳原子通常被甲基化，且两个甲基集团在DNA 双链大沟中呈特定三维结构。基因组中60% 90% 的CpG 都被甲基化，未
14、甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛，位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点。有实验证明超甲基化阻遏转录的进行。DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化，使DNA 失去核酶ö限制性内切酶的切割位点，以及DNA 酶的敏感位点，使染色质高度螺旋化，凝缩成团，失去转录活性。5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶（C-T转换），由此可能导致基因置换突变，发生碱基错配，如果在细胞分裂过程中不被纠正，就会诱发遗传病或癌症。酶的分类编辑动物中DNA 甲基转移酶有两种： 1） DNM T1，持续性DNA 甲基转移酶 作用于仅有一条链甲基化的DNA 双链，使其完全甲基化，可参与DNA
15、复制双链中的新合成链的甲基化，DNM T1 可能直接与HDAC （组蛋白去乙酰基转移酶) 联合作用阻断转录； 2）DNM T3a、移酶可能参与细胞生长分化调控，其中DNM T3b在肿瘤基因甲基化中起重要作用。去甲基化编辑有两种方式： 1） 被动途径： 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNM T1 的作用； 2） 主动途径： 是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn
16、、N F2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录，但是，甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子（SP1、CTF、YY1）,使它们失活，从而阻断转录。人们已发现5 种带有恒定的甲基化DNA 结合域（MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 参与甲基化有关的转录阻遏；MBD1 有糖基转移酶活性，可将T 从错配碱基对TöG 中移去，MBD4 基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2 缺陷的小鼠细胞中，不含M ECP1 复合物，不能有效阻止甲基化基因的表达。这表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的选择，以及
