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1、,第八章 植物基因的克隆原理与技术,内 容,一基因克隆所需要的酶和载体 二植物转化载体的构建 三基因克隆的方法,基因克隆所需要的酶和载体,一般认为 基因工程诞生于1973年 上世纪40年代70年代初 分子生物学领域 理论上的三大发现和技术上的三大发明 对于基因工程的诞生起到了决定性的作用。,1- DNA是遗传物质被证实,1944年，Avery O.T.肺炎双球菌转化实验,1953年，James Watson 和Francis Crick提出了DNA的双螺旋模型。,以Nireberg等为代表的一批科学家确定了遗传信息以密码方式传递，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸，到1966年，全部破
2、译了64个密码子，并提出了遗传信息传递的“中心法则”。,Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。,Werner Arber 1968年发现限制酶,1967年，世界上五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年Khorana等发现的T4 DNA连接酶具有更高的连接活性。,1970年，Baltimore等和Temin等各自发现了反转录酶，完善了中心法则，使单个真核基因的制备成为了可能。,1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组。,1973年，Stanford大
3、学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。 这一年被定为基因工程诞生的元年。,植物基因工程的基本流程,基因克隆所需要的酶类,限制性内切核酸酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 核酸外切酶 单链DNA内切酶,“ ”,1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的命名和分类 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应,限制性核酸内切酶,限制性内切核酸酶的发现 50年代发现了大肠杆菌具有对付噬菌体和外来DNA的限制系统； 60年代后期证明了细菌的限制和修饰系统； 1968年，Meselson 和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶
4、； 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶Hind II，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。,限制（Restriction） 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,修饰（Modification） 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,限制性核酸内切酶的概念,限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300种微生物中分离出了2300种，其中商品
5、化的限制性核酸内切酶500余种。,限制性核酸内切酶的命名,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称。 如：大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco ；,属名,流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为Hin；,种名,2、修饰性酶用M表示，限制性酶用R表示 如 R. Hin M. Eco 3、用一个正体字母表示菌株的类型 如Escherichia coli RY13 Eco R 4、以罗马数字表示分离出来的先后顺序 如Eco R I、 Hin d III,限制性内切核酸酶类型： 目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。
6、 I 型限制性内切酶 II 类限制性内切酶 III类限制性内切酶,限制性核酸内切酶的分类,不同类型核酸内切酶主要特性的比较分析,I 型,II 型,III 型,限制-修饰活性,单一多功能的酶,限制酶和修饰酶分开,双功能酶,内切酶的蛋白质结构,3种不同亚基,单一成分,2种不同亚基,活性辅助因子,ATP、Mg2+、 SAM,ATP、Mg2+、 SAM,Mg2+,甲基化位点,寄主特异性的位点,特异性切割,否,是,否,基因克隆中的用途,用途有限,十分广泛,用途有限,II型限制性核酸内切酶的3大特点,识别位点的特异性 识别序列的对称性 切割位点的规范性,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端 ( co
7、hesive ends )：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。,5端凸出（如EcoR I）,3端凸出（如Pst I）,平 末 端 (Blunt end)：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。,同裂酶 (isoschizomers )：能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。,完全同裂酶 识别位点和切点完全相同 如Hind 和Hsu I,不完全同裂酶 识别位点相同但切点不同 如Xma I 和 Sma I,Xma I 5-C CCGGG
8、 -3 3-GGGCC C-5 Sma I 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-5,同尾酶(isocaudamers):识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。 注 意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,BamH I,G GATCC,CCTAG G,5-,-3,3-,-5,Bgl II 5-A GATCT-3 3-TCTAG A-5,经同尾酶消化的DNA末端连接示意图,5 XXXXGGATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 X
9、XXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,5 XXXXA GATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCCXXXXXX 3 3 XXXXTCTAGGXXXXXX 5,BamH I,Bgl II,影响酶活性的因素很多： DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素 纯度的鉴定：紫外吸光值A260/A280 浓度低于500ng/
10、 L 酶切消化的缓冲液 Mg2+ Tris-HCL BSA（牛血清蛋白） 酶切反应的温度（通常为37） 影响酶切消化的其他因素 时间 体积 RNA,限制性核酸内切酶的消化反应,酶切反应的基本步骤,Buffer (10) 2.0 L Water 16.5 L DNA 1.0 L Enzyme 0.5 L Volume 20.0 L,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略,DNA连接酶及其应用,DNA连接酶的发现,T4DNA连接酶:由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。 容易制备，而且可以连接
11、完全配对的平末端DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。,DNA连接酶:由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,DNA连接酶作用的特点,A. 连接的两条链必须分别具有 3端自由羟基（-OH） 和5端磷酸基团（-P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应； B. 连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。,DNA连接反应的条件,CK-,CK+,重组菌,影响连接效率的因素有： 温度（最主要的因素） dNTP的浓度(10M-1M) 连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高） 反应时
12、间（通常连接过夜） 插入片段和载体片段的摩尔比,平末端DNA片段的末端加尾连接法,平末端DNA片段加接头连接法,衔接物(linker)，也叫接头，是有人工化学合成的一段10-12个核苷酸的DNA双链，其中包含有1个或几个限制性酶切位点。使用时只须将衔接物和目的片段的5端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的DNA片段。,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,磷酸化,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,P,OH,OH,P,P,P,OH,OH,T4连接酶,CCGAATTCGG GGCTTAAGCC,P,OH,P,OH,EcoR I,CC
13、GAATTCGG GGCTTAAGCC,AATTCGG GCC,CCG GGCTTAA,大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 Taq聚合酶 逆转录酶,DNA聚合酶及其应用,常用DNA聚合酶的特性比较,逆转录酶 一种可以有效地将mRNA转录成为DNA的酶，其产物称为cDNA (complementary DNA)。实际上，是一种RNA依赖的DNA聚合酶。 来源 RNA肿瘤病毒。 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus, AMV）和鼠白血病毒反转录酶（avian myeloblastos
14、is virus, M-MLV） AMV的性质 由和两条多肽链组成。,聚合酶活性和 RNaseH活性。 RNaseH： 经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。,RNaseH,RNA,DNA,逆转录酶的用途 合成cDNA 以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,RT-PCR用的模板 克隆某个基因时，用其mRNA反转录出cDNA第一链。,mRNA 5,A A A A A A,T T T T T T,3,5,DNA修饰酶 末端脱氧核苷酸转移酶 T4多核苷酸激酶 碱性磷酸酶,细菌性碱性磷酸酶 Bacterial alka
15、line phosphatase，BAP 从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。,碱性磷酸酶,小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP 从小牛肠中纯化出来。SDS中加热68可完全失活。,碱性磷酸酶的特性： 催化脱掉DNA（或RNA）5端的磷酸根。,碱性磷酸酶,Hind酶切,5AAGCTT TTCGAA 5,碱性磷酸酶,易载体自连,碱性磷酸酶的功能,防止线性化的载体份子自我连接,外源DNA,连接酶,转入细菌后会被修复,基因工程载体,基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。,分子较小，可携带比较大的DNA片段。 能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites，MCS）。 有适合的标记，易于选择。 有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等。,载体需要满足的条件,载体分类 根据功能分： 克隆载体:克隆一个基因或DNA片断 表达载体:用于一个基因的蛋白表达
