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1、基因编辑技术 ZFN、TALEN、CRISPR/Cas,20141210 wing,基因编辑的三大利器,ZFN (Zinc-finger nucleases, ZFN) TALEN（transcription activator-like effector nucleases) CRISPR/Cas (clustered regulatory interspaced short palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）,特异性 DNA识别域,非特异性 核酸内切酶,+,2,ZFN原理,ZFN=DNA识别域+核酸内切酶
2、DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般34个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。,TALEN,TALE（Transcription activator -like effectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。 科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas sp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源
3、基因的表达调控。 目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。,4,TALEN原理,TALEN=DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识 别并结合一个对应的碱基。 核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA,5,全长为34aa的Tal 蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。 NG可以识别T HD可以识别C NI可以识别A NN可以识别G或A 通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上Fok I核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。
4、,TALEN原理,6,TALEN的特异性打靶的原理： 一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域； 然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strand break，DSB）； 再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。 FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。,TALEN原理,7,TALEN介导的基因编辑,TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。 形成DSB时，同源
5、重组可将需要敲入的序列组合入基因组。,TALEN的技术特点,任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活 成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上 打靶效率高，可完全替代RNAi技术 脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应 周期短，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒,9,CRISPR/Cas系统,CRISPR序列： 细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）。 Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associated ge
6、nes） CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统： CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。,10,CRISPR/cas系统的发现,1987年发现苗头：大阪大学研究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。 随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端，有多组DNA序列+反向序列+约30bp随机序列（spacer DNA）。这种由多组重复片段和空格片段组成的成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被称为CRISPR（clustered regularly inter
7、spaced short palindromic repeats）。 2005年提出假说：3个生物信息学课题组报道， CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序列互补匹配。假说：提示细菌可能CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关，可能细菌通过获得噬菌体DNA，转录形成RNA后与入侵的外源DNA结合，起到类似RNA干扰的作用。,11,2007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和 Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力。（Science, 23, 2007, p1650） 德国学者机制研究
8、：Helmholtz、Doudna和、Charpentier分别对不同的 CRISPR及相关系统（ CRISPR associated systems, cas）进行了研究，阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中依赖Cas9蛋白的CRISPR系统更简单。,噬菌体激活 细菌 CRISPR/ Cas9系统 长链RNA分子 含空格序列的小RNA, crRNA,共同降解与 crRNA互补的外源DNA分子,tracrRNA与Cas9蛋白,tracrRNA（trans-activating chimeric RNA），非编码RNA，促进 crRNA形成
9、，是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用的辅助因子。 (Charpentier et al, Nature, 2011),CRISPR/cas系统的发现,12,CRISPR/Cas原理,CRISPR-Cas9=DNA识别域+核酸内切酶 DNA识别域：向导RNA 核酸内切酶： Cas9核酸内切酶 向导RNA由两部分组成：CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA (transacting CRISPR RNA, tracrRNA) crRNA一端与双链核苷酸互补结合，另一端与tracrRNA互补结合，形成向 导RNA。,13,CRISPR/Cas系统分类,根据CRI
10、SPRCas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPRCas系统区分成3种类型：,TYPEI,TYPEII,TYPEIII,14,PAM：NGG,Cas9蛋白与向导RNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。 CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5-NGG-3），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。,CRISPR/Cas9,15,CRISPR/Cas9系统优势,ZNF成本高昂，效率低。 Cas9的效率是TALEN的5倍。 sgRNA全长不超过100bp，构建更容易（因为每一对TALENs都需要
11、重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换20个核苷酸就行） 可任意对基因组精确定位和改造 价格低廉：设计向导RNA的免费软件；美国Addgene机构提供构建CRISPR系统的DNA分子，收费65美元。,16,基因活性调控功能 : 免疫系统不宜发现细菌细胞膜脂蛋白成分。因此，该系统除切割噬菌体基因以外，还具有调节细菌基因表达的能力，这是一项新发现。有CRISPR系统的细菌致病力较强。（TimEmory Univ研究显示，细菌感染哺乳动物细胞时，其CRISPR基因可关闭脂蛋白合成。因此othy R. Sampson, David S. Weiss et al. A CRISPR-CAS s
12、ystem mediates bacterial innate immune evasion and virulence. Nature, 14 April 2013 ） Qi等改造Cas9蛋白，其在向导RNA介导下与特定的DNA序列结合，但不切断DNA链，类似于RNAi技术 。在细菌中表现为抑制基因转录，但在哺乳动物细胞内，如在Cas9蛋白上添加了一个抑制子，可抑制基因的活性，此时向导RNA主要与靶基因上游的调控序列启动子区域结合，类似于RNAi技术，能够以可逆的方式使基因失活,CRISPR/Cas系统的应用,17,CRISPR/Cas系统的应用,Jinek et al的向导RNA分子（si
13、ngle-guide RNA）：将tracrRNA和空格 RNA组合构建成的向导RNA，与Cas9蛋白混合，实现在特定DNA位点对基因组进行切割改造（Science, 2012，p.816） Church团队：用人细胞系进行实验，构建了一个数万条向导 RNA文库，这些RNA分子能够特异性地与90%人类基因结合（Science, 2012，p.823） Zhang Feng: 用 CRISPR技术可以同时对人类细胞里的两个基因进行特异性的切除（Science, 15 February, p. 819）; Jaenisch合作，一次性破坏了小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cell）里
14、的5个基因。 Zhang将编码Cas9蛋白的 mRNA和两条向导RNA分子直接注入了小鼠的受精卵细胞，成功地敲除了两个基因，成功率达到了80%。此外控制Cas9蛋白的酶切活性，使其只在DNA链上切开一个小口，而不能将其彻底切断，借助同源重组修复机制在被切开的位点插入一个新的基因（Cell,2013) 。,18,科学院遗传所高彩霞团队：成功地使四种水稻基因失活（Nature Biotechnology, 2013） 在模式生物中的应用:成功地对线虫（左）、斑马鱼胚胎（中）和果蝇进行遗传学改造，获得更粗短的线虫，腹部组织体积更大的斑马鱼胚胎，和眼睛颜色更深的果蝇，表明CRISPR技术在动物基因改造
15、方面有巨大应用潜力。 美国加州大学旧金山分校（UC San Francisco）的Lei S. Qi等人与Doudna合作，发明了类似于RNAi技术的 CRISPRi技术，能够以可逆的方式使基因失活，这种技术在研究基因功能方面潜力巨大。,CRISPR/Cas9系统的应用,CRISPR技术改造的水稻,19,CRISPR/Cas9技术方案,利用设计向导RNA的免费软件设计single-guide RNA，或查找guide RNA文库，合成特异性guide RNA 编码Cas9蛋白酶的质粒或mRNA 转染细胞：guide RNA+编码Cas9蛋白酶的质粒或mRNA,20,CRISPR/Cas9表达策
16、略,21,CRISPR/Cas9的特点和优势,操作简单，靶向精确性更高。sgRNA 靶向序列和基因组序列必须完全匹配，Cas9 才会对DNA 进行剪切。编码sgRNA 的序列不超过100bp，因此比构建TALENs 和ZENs更简单方便，用于CRISPR 的sgRNA 识别序列仅需20 个核苷酸。 CRISPR/Cas9 系统是由RNA 调控的对DNA 的修饰，其基因修饰可遗传。 基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等 可实现对靶基因多个位点同时敲除。 无物种限制。 实验周期短，最快仅需2 个月，节省大量时间和成本。,22,CRISPR技术存在问题和解决方案,目前不清楚向导RNA分子的特异性作用机 脱靶效应（off-target effect）。Joung的工作显示，与向导RNA序列类似的非靶点DNA片段也能够被切断、激活或 者失活，即存在明显的脱靶效应。 新方法解决CRISPR-Cas系统难点 可减弱甚至消除消除脱靶效应 利用计算机模型。 调整导向RNA序列的量 计算高目标效应和低脱靶效应间最优平衡点 最新研究表明，增长
