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1、,核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳,目录,核酸 组成 理化性质 核酸分离、纯化的原则 核酸提取的基本步骤 材料准备 细胞裂解 分离、纯化 沉淀溶解 DNA提取的常用方法 RNA提取的常用方法 核酸的保存 琼脂糖凝胶电泳,核酸,DNA,RNA,Genomic DNA ( 原核、真核、病毒 ),细胞器DNA ( 叶绿体、线粒体等),质粒DNA ( 细菌、放线菌等 ),mRNA ( 1%-5% ) rRNA (80%-85%) tRNA(小分子RNA) (15%-20%),核 酸(nucleic acid),核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。,核酸的理化性质,理化性质 DNA化学性质
2、稳定，物理上易碎，粘度大 RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染 溶解性 均溶于水 不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀,核酸分离、纯化原则,1、保持核酸分子一级结构的完整性 温度不要太高 控制pH值范围(pH值5-9) 保持一定离子强度 减少物理因素对核酸的机械剪切力,核酸分离、纯化原则,核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 所用器械和一些试剂需高温灭菌 提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂,2、防止核酸的生物降解,DNA酶抑制剂,金属离子螯合剂： DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。 阴离于型表
3、面活性剂 SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。,RNA酶（RNAase)抑制剂,DEPC(二乙基焦碳酸盐) 粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His 结 合使蛋白变性。 使用注意： 1.DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。 2.容易降解，保存在4 或液氮中； 3.剧毒。,1：手指头 2：枪头 3：水/缓冲液 4：实验台面 5：内源 Rnase 6：RNA 样品 7：质粒抽提 8：RNA 保存 9：阳离子 (Ca, Mg) 10：后续实验所用的酶,Rnase 污染的10大来源,DNA提取的基本步骤,I.材料准
4、备 II.裂解 III.分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸 V.溶解,材料准备,使用新鲜材料，样品材料不要反复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞） 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,基因组DNA的提取,细胞裂解,裂解液 经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶,含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA 高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA 含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组 DNA 含SDS碱裂解法：质粒DNA,核酸分离、纯化,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢
5、键破坏，核蛋白解聚； 蛋白酶处理,核酸分离、纯化,多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。,核酸沉淀、溶解,重新调整核酸的浓度； 去除溶液中某些盐离子与杂质。,乙醇 优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后实验。 缺点： 需要量大，一般要求低温操作。 异丙醇 优点： 需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70乙醇漂洗。,有
6、机沉淀剂,核酸的保存,(1) 对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿。 (2) 对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;,DNA提取的常用方法,基因组DNA的提取,SDS法 其它,原理,基因组DNASDS法,SDS在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS提取缓冲液的配方,Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ED
7、TA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中； SDS 裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,其他方法,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交
8、换树脂,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,磁珠,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,硅质材料,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。,硅质材料,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。,硅质材料,阴离子交换树脂,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,阴离子交换树脂,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。,阴离子交换树脂,磁珠,磁性微粒
9、挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,磁珠,Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎。 核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来。 异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性。,TRIZOL法提RNA,目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。,问题一：DNA降解,材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老 提取操作过于剧烈，DNA被打断 外源核酸酶污染,低温保存，避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液 增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后操作
10、应尽量轻柔 试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融,核酸提取常见的问题,问题二： DNA样品不纯,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤的次数（2-3次）,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出
11、，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,RNA提取常见问题一：样品不纯,蛋白 多糖多酚 DNA 离子,保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心 增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化 加入不含RNase的DNase处理 增加洗涤次数,RNA提取常见问题二：得率低,样品太多或太少 RNA在柱子上未洗出 洗出液中有酒精,减少或增加样品使用量 加入RNaseFree,放置几分钟再离心 漂洗后再次离心,RNA提取常见问题三：降解,样品不新鲜或保存不当 RNase污染 RNA溶液储存不当,取新鲜的样品；取样后立即放入液氮或储存液保存 研磨样品及时补充液氮 严格处理相应的器具和试剂 -70 冻存，分装使用,为了检测
12、提取核酸的浓度和内参，需要继续做琼脂糖凝胶电泳实验,实验原理,（1）DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。,（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶缓冲液,（1）制备凝胶和胶板： 100ml(1TBE)+1g琼脂糖（ 三角瓶 ）， 煮胶，溶解，冷却至60(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子 。,（2 ）加样： 5l质
13、粒DNA+1l loading buffer ，混匀 5lPCR产物+1l loading buffer，混匀 （3 ）电泳：电压80-120V，注意电极 方向 15min （4 ）观察：紫外透射分析仪下观察。,电泳常见问题分析,DNA降解：避免核酸酶污染。 电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避免温度高变性,条带浅，Marker弥散了-那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。化胶的时候一定要化匀，buffer尽量用新鲜的 实验室跑一般都是120V,最多跑到150V,DNA电泳常见问题分析,谢谢大家,
