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1、1,第二章 细胞工程研究常用设备和技术,实验室设计 实验室常用仪器设备 基本技术 培养基及其配制,主要内容,2,细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；无菌操作；控制培养。,第一节、实验室设计,5,一、基本实验室 准备室：准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室：接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。房间一般不宜过大，其规模根据实验需要而定。接种室除了出入口和通气口外，其余应密闭。 培养室：培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感
2、染，培养室应保持干燥和清洁。,8,基本实验室-培养室,9,二、辅助实验室,细胞学实验室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。 摄影室及暗室：其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 细胞工程实验室布局的其基本要求是：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。,10,第二节 实验室常用仪器设备,一、水纯化装置,用于细胞工程的培养基和其他溶液一般都要用双蒸水或三次蒸馏水来配置。 实验室常
3、用的纯水装置：不锈钢蒸馏水器、石英自动纯水蒸馏器、超纯水装置。,11,不锈钢蒸馏水器,12,13,主要由多个过滤部件组成。水先经过预过滤层除去粗杂质，然后经过有机层、去离子层、去热原层，再经过0.22微米滤膜过滤除菌，得到超纯水。,超纯水装置,14,二、超声波清洗器,超声波清洗功能主要是利用超声波在液体中的“空化”作用，使黏附在物体表面的各类污物剥落，同时超声波在液体中又能加速溶解作用和乳化作用，再加上合适的清洗剂配合，就可以达到清洗目的。 超声波清洗效果好、速度快，尤其对于采用一般常规清洗方法难于达到清洁度要求，以及手工清洗解决不了的缝隙、小孔、内腔等。,15,16,三、蒸汽压力消毒器,实验
4、室中最常用的灭菌设备就是高压蒸汽灭菌器。常见的有立式、卧式和手提式几种。,基本操作步骤： 向锅内注水到规定刻度，注意保持导气管通畅； 将待灭菌物放入锅内，盖紧锅盖； 通电加热，排放冷气； 加热至压力额定值，开始计时； 计时结束，切断电源，自然降压至接近零； 灭菌器盖微开5 min，取出灭菌物；,17,18,19,20,21,四、干热灭菌干燥箱,用于器械和玻璃器皿的干热灭菌或烘干。 使用方法如下：,将待灭菌物放入箱内，注意不要放得太挤，以利空气流通； 关箱门，接通电源，打开开关，旋动恒温调节器至指定温度。若需鼓风，则应与升温同时开始，不能先升温后鼓风，以免导致起火或玻璃器皿破裂； 温度上升至指定
5、温度后，维持所需的时间； 灭菌或烘干完毕后切断电源，待温度降至70以下时，可开箱取物；,22,五、过滤除菌装置,1. 蔡氏滤器 使用混合纤维素酯微孔滤膜，孔径有0.22微米、0.45微米等不同规格。蔡氏滤器可分为抽滤式（负压，抽真空）和加压式（正压，氮气加压）两种。 2. 针头式滤器 针头式加压塑料小滤器的上下部件为螺旋式连接，中间夹一层微孔滤膜（常用孔径为0.22微米），滤器上部的进液口可直接接在注射器上，液体经注射器加压进入滤器，经过膜过滤除菌后，由滤器下部的出液口流出。,23,24,六、超净工作台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
6、净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,25,超净工作台是以空气过滤去除杂菌孢子和灰尘颗粒来达到空气净化目的的装置，主要由鼓风机、滤板、操作台和照明灯组成。 单人和双人，垂直和平流； 75%酒精擦拭超净台，放入器械，开紫外灯30min，关闭紫外灯，点燃酒精灯在下火焰方进行操作。,26,27,生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。,七、生物安全柜,28,根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为一级、二级和三级三种类型。,一级生物安全
7、柜可保护工作人员和环境而不保护样品。 二级生物安全柜是目前应用最为广泛的柜型。二级生物安全柜依照入口气流风速、排气方式和循环方式可分为4 个级别：A1 型，A2 型，B1 型和B2 型。所有的二级生物安全柜都可提供工作人员、环境和产品的保护。 三级生物安全柜是为生物安全防护等级为4级实验室而设计的，柜体完全气密，工作人员通过连接在柜体的手套进行操作，俗称手套箱(Golve box)，试验品通过双门的传递箱进出安全柜以确保不受污染，适用于高风险的生物试验，如进行SARS、埃博拉病毒实验等。,29,传染病的传染性和危害性并不相同，传染病原分为四个危害等级。 第一级危害群微生物：与人类成人健康和疾病
8、无关； 第二级危害群微生物：引发人类患病，但很少出现严重情况，通常有预防及治疗方法； 第三级危害群微生物：引发人类患病，并出现严重或致死情况，但可能有预防和治疗方法； 第四级危害群微生物：引发人类患病，并出现严重或致死情况，但通常无预防与治疗方法，诸如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。,30,31,32,33,八、培养箱,细胞在离体培养时，都需要一定的温度，尤其是哺乳动物细胞的要求较高，在多数情况下温度变化不能超过0.5。 动物细胞培养 恒温培养箱包括能控制和调节温度的一般培养箱为增加了湿度和CO2调节的二氧化碳培养箱。 植物细胞培养 增加了照明条件的光照培养箱、人工气候箱。,37,
9、九、显微镜,体视显微镜（解剖镜）：用于观察和剥离较小器官和组织，也可用来观察愈伤组织的生长和发育。,38,透射显微镜：物镜在载物台上方，用于观察切片、压片、涂片等。,39,倒置显微镜：物镜在载物台下方，可以从培养皿、培养瓶或摇瓶的下方观察培养物，用来实时观察活细胞的生长情况。,40,显微操作系统：用于对细胞进行显微操作，如细胞核移植、染色体操作、显微注射、胚胎切割等工作。,41,第三节 基本技术,1洗涤液 铬酸洗涤液是用重铬酸钾(K2Cr2O7)与硫酸(H2SO4)配制而成，可根据需要配制成弱、中、强三种。,一、洗涤技术,42,弱 用重铬酸钾50g加入蒸馏水1L，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫
10、酸90ml。 中 用重铬酸钾50g加入蒸馏水100ml，加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸875ml。 强 浓硫酸加热的同时缓慢加入磨碎的重铬酸钾，直到重铬酸钾达到饱和为止。一般浓硫酸1L加入重铬酸钾50g。,43,玻璃器皿洗涤 塑料用品洗涤 金属用品洗涤,2洗涤方法,不同材料的器械，洗涤方法不同。,44,玻璃器皿洗涤 新的玻璃器皿上附有游离的碱性物质，其洗涤方法是用1%的HCl溶液浸泡24h，再用洗涤剂洗刷，然后用清水反复冲洗，最后用蒸馏水冲洗12次，干燥后即可使用。 已使用过的试管、烧杯、三角瓶等，先将器皿中的残渣除去，用清水洗净，再用洗涤剂洗刷，用清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗12次。 用
11、过的吸管、滴管等内径狭小的玻璃制品，需先放入铬酸洗涤液中浸泡两小时以上，取出后经流水冲洗半小时左右，再用蒸馏水冲洗12次，然后烘干或晾干。,45,载玻片和盖玻片容易破碎，洗涤时不宜用力擦洗，其洗涤方法是先用清水冲洗，然后放入铬酸洗涤液中浸泡几小时或用稀铬酸洗涤液煮沸半小时，取出后用清水冲洗干净，将其储藏在95%的酒精中。 塑料用品洗涤：塑料用品一般用合成洗涤剂洗涤，因其附着力较强，因此冲洗时必须反复多次，最后用蒸馏水冲洗。 金属用品洗涤：金属用品一般不宜用各种洗涤液洗涤，需要清洗时，一般用酒精擦洗，并保持干燥。,46,二、灭菌和消毒技术,物理方法：干热、湿热、射线处理、物理除菌过滤、离心沉淀等
12、； 化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌；,培养基灭菌、玻璃器皿灭菌、金属用具灭菌、接种室灭菌、外植体灭菌。,47,几种常用消毒剂效果比较,48,第四节 培养基及其配置,用于植物离体培养的培养基至少包括无机盐；有机化合物；生长调节剂三大基本组成以及根据不同需要的其它附加成分。,49,一、无机盐类,必需元素在体内的生理作用主要包括四个方面： 组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质； 构成一些特殊的生理活性物质，如植物激素、酶以及酶的活化剂，参与植物的代谢活动； 元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等生物电化学方面的作用； 发育过程中，影响组织器官的建成；,50,二、有机化合物,
13、糖类 既可作为C源，又可维持培养基的渗透压。植物组织培养中常使用蔗糖，在某些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。 维生素 为了使培养物生长得更好，根据培养目的不同常在培养基中添加一种或多种维生素。常用的维生素包括VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp(烟酸)、VH (生物素)、VBc（叶酸）、VB5（泛酸钙）等。,51,肌醇 化学名称环己六醇。肌醇本身并没有促进生长的作用，但它在糖类的相互转化、维生素、激素的利用等方面具有重要的促进作用，所以它能使培养物快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响。 腺嘌呤 腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体之一，外源添加腺嘌
14、呤有利于细胞协调自身合成细胞分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。 氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分。常用的氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白等。,52,三、植物激素,生长素类 常用的生长素有IAA(吲哆乙酸)、NAA (奈乙酸 )、2,4-D(二氯苯氧乙酸)和IBA(吲哆丁酸)等。 细胞分裂素类 常用的细胞分裂素有KT (激动素)、BA(6-卞基腺嘌呤)、2-ip(异戊烯氨基嘌呤)、玉米素等。近年来TDZ（苯基噻二唑基脲）亦作为一种新的细胞分裂素在许多离体培养研究中使用。 赤霉素类 此外，根据不同培养目的， ABA(脱落酸)、乙烯、B9、CCC(矮壮素)等生长抑制物质有时也被用于调节培养物的生长发育过程，如诱导某些变态器官的发生等。,53,天然提取物，如椰乳、番茄汁、YE(酵母提取物) 琼脂 活性炭,四、其它物质,
