《新功能人造生物器件的构建与集成》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新功能人造生物器件的构建与集成（19页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、项目名称：新功能人造生物器件的构建与集成首席科学家：起止年限：2012.1-2016.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容合成生物学的基点是：基于工程化策略，采用标准化生物元件，构建通用型生物学模块，在有目的设计思想指导下，组装具有特定新功能的人工生命系统。相比其它工程领域（如电子工程）的研究对象，生命体系是高度动态、灵活调控、非线性、且不可预测的。如此复杂的体系如何以工程化的设计，获得特定的人工生物器件或生命系统，是合成生物学研究面临的核心科学问题。围绕着这一重大科学问题，本项目拟在生物元件、模块、途径、网络等层次上解决设计、合成、组装、调试等问题，即（1）生物功能器件（元件和模
2、块）的设计原理；（2）生物功能器件的人工合成与标准化；（3）生物功能器件的适配机制。1、拟解决的关键科学问题1）生物功能器件的设计原理提高对功能模块和元件的设计能力，是实现化合物生物合成途径组装的前提。生物的代谢多样性（特别是微生物和植物），决定了它们具有非常强大的合成各种初级和次生代谢产物的能力。然而，自然界中任何一种生物拥有的酶系种类和催化效率均有限，一般不能满足生产的需要。因此，根据目标化合物的结构特征，确定相应的生化反应类型，利用自然代谢的多样性，从基因组数据库中寻找、解耦、抽提相关的元件和相应的功能模块；基于对元件的功能表征，将相关代谢途径模块化，利用数学模型模拟计算不同元件组合后的
3、功能输出，设计并优化生物合成途径，在底盘细胞上组装，有可能提高构建复杂代谢途径的效率，实现人造生物功能组合合成的工程化。同时，分析元件与功能模块的分子基础，包括物种的密码偏好性，将有利于理解自然元件进化的本质，指导元件与模块以功能优化为目的的人工进化。2）生物功能器件的人工合成与标准化生物功能元件是合成生物学研究的基石。编码酶蛋白的结构基因是代谢途径的基本结构元件，其序列决定了所编码蛋白的一级结构和催化效率。DNA结构元件在宿主细胞中的表达程度和活性受到调控元件的控制，它们共同组成了可催化某一步特定生化反应的简单功能模块。目前，用于合成生物学研究的元件库容有限，对它们的理解和功能表征不够；许多
4、天然元件往往需要在改造后才能用于合成生物学研究。同时，高通量、低成本、高保真的DNA合成技术尚未建立，还不能大规模地人工合成新功能元件。发掘自然代谢的多样性，分析基因与蛋白等生物元件的结构、功能、调控以及分子进化特征，在现有生物学和基因组知识的指导下人工设计合成各种新功能元件，对各类元件进行工程性的定量的功能表征，建立代谢功能和调控功能明确的元件库和模块库，建立标准化的元件组装技术。为我国合成生物学发展提供实用的生物元件库，建立基于标准生物元件的合成代谢途径的技术体系，实现人造生物功能的组装合成。3）生物功能器件的适配机制合成生物学的目标是组装一系列具有特定代谢功能的分子模块，并赋予其整体功能
5、。然而，人们对活细胞工作原理的了解还远远没有达到对电子机械设备工作原理所了解的程度，直接对自然界的器件进行组装常常不能按预期模式互相耦合，导致人工生物合成路线发生故障。同时，导入的生物合成功能模块往往会对底盘细胞造成很大的影响，甚至会抑制细胞的生长，也使得生物合成途径不能有效地工作。元件与元件之间、元件与模块之间、功能模块之间、以及功能模块和底盘细胞之间的适配程度，决定了生物合成途径的整体效率。建立高通量的检测与调试平台，对器件之间的组合在底盘细胞上进行高通量的测试，在此基础上认识并且优化器件之间的适配性。从基因、蛋白、网络、细胞的层面上理解各种模块组合对底盘细胞的影响，可以指导人工生物系统的
6、组装优化。在基因组规模上分析人工细胞生物合成能力对遗传和环境扰动的响应，将有利于揭示人工细胞功能进化的遗传机理，深入理解化学品生物合成的调控机制，实现在底盘细胞上模块之间的优化磨合对接，极大地提升合成人工细胞的能动性和精确度。2、主要研究内容针对生物功能器件设计原理的科学问题（1），本项目研究将集中于通过整合各种组学数据，建立大肠杆菌、链霉菌和酵母等底盘细胞的代谢网络和调控网络模型，指导模块的设计合成以及人工细胞改造。分析基因组信息和生化反应数据信息，设计目标化合物合成途径。将设计的合成途径与底盘细胞网络模型虚拟整合，分析两者代谢的相容性，鉴定出目标化合物合成最优路线，并模拟预测网络中的重要途
7、径及关键分支节点，提出人工细胞系统优化的策略以实现目标化合物合成途径的流量最大化。分析代谢途径网络的连通结构，建立功能模块的解耦方法，为目标化合物合成途径的组装提供设计方案。对生物元件进行数学建模，模拟计算不同元件组合后的功能输出，实现模型指导的功能模块的设计。针对生物功能器件人工合成与标准化的科学问题（2），本项目研究将集中于发展规模化的生物元件发掘、合成、工程性鉴定表征、以及标准化的技术与工程平台。发掘天然元件的多样性，尤其是目标化合物合成途径中的催化元件。研究基于微流芯片的寡聚核苷酸片段高通量并行合成技术，改造开发低成本、高保真的中通量DNA合成技术以及大片段DNA高效保真的体外和体内的
8、拼接技术，高效精确地合成目标DNA元件。发展密码子优化技术，提高异源结构元件在底盘细胞中的表达强度。结合蛋白理性设计和定向进化技术，提高结构元件催化相关生化反应的活性。在元件功能表征的基础上，构建催化各类通用生化反应或特殊反应的结构元件库。同时构建大肠杆菌、链霉菌和酵母等底盘细胞的启动子、核糖体结合位点、非编码RNA、及合成蛋白骨架等调控元件库，并对其进行工程表征，精确定量调控强度。建立标准化的元件接口和串联组装技术，高效组装具有特定功能的受调控的分子模块，组装聚酮类、萜类等化合物生物合成途径。发展底盘细胞的高效同源重组技术，提高功能模块的组装效率。针对生物功能器件适配机制的科学问题（3），本
9、项目的研究将集中于建立高通量的底盘细胞改造平台以及元件组合和模块集成适配性检测平台，实现in silico、in vitro和in vivo进化优化技术的统一。利用代谢控制分析技术揭示目标化合物生物合成途径中代谢流的关键动力学节点与限速步骤。研究重要中间产物等对目标化合物合成途径的调控作用，研究终产物或中间产物对关键催化元件的反馈抑制或反馈阻遏机理，进行相关催化元件的分子进化改造。采用定量表征的启动子、核糖体结合位点和非编码RNA元件、以及合成蛋白骨架技术，对功能模块中的催化元件进行精确调控，以优化模块之间的适配性、解除途径的限速步骤，使人工细胞合成目标化合物的代谢通量达到最大化。通过多重基因
10、组自动改造技术，在多基因水平对功能模块之间的适配性进行进一步的优化，实现高效生物合成途径的创建。发展大肠杆菌和链霉菌的新型高效遗传操作技术，对宿主细胞的代谢途径网络进行高通量的改造，重新分配其物质流、能量流，提高人工细胞合成目标产品的生产能力。采用转录组、蛋白质组、代谢物组、代谢流量组等组学分析技术，分析生物合成途径的导入对宿主细胞的影响，鉴定出人工细胞生产能力提高的遗传机制，优化其目标化合物的合成能力。二、预期目标1. 总体目标实现人造生物器件构建及集成关键科学和技术问题的重大突破，建立大片段DNA高效合成拼接技术体系，建立生物元件合成与表征、模块设计与集成、系统组装与调试等工程平台，建立代
11、谢和调控功能明确的标准化元件库和通用型模块库；在此基础上，探索萜类和聚酮类等重要天然产物的新生物合成路线，在埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷等天然药物的生物合成方面形成优势和特色。培养和造就一批青年学科带头人和学术骨干，促进我国合成生物学快速成长和长远发展。2五年目标1）突破生物器件人工合成组装与标准化的技术瓶颈，建立人造生物器件及集成的关键技术：建立高通量高保真大片段DNA合成拼接技术体系，发展规模化的生物元件发掘、合成、工程性鉴定表征、以及标准化的技术与工程平台；建立代谢网络模拟和化合物合成途径设计平台；建立高通量的元件组合和模块集成的适配性检测平台、以及底盘细胞的改造平台。2）阐明生物功能器件
12、（元件和模块）的设计原理，建立标准化的生物元件库：完成30-40个化学品合成相关的基因元件的发掘、合成和功能表征；构建3-4种大肠杆菌、链霉菌和酵母的工程性鉴定过的调控元件库；设置DNA元件的标准接口，相应建立生物元件及功能模块的标准化组装技术；构建标准化、高通用性的新载体及染色体改造系统，规模化整理和文档化生物元件库。3）探索生物功能器件的调试及适配机制，实现重要天然化合物的异源合成并提高产量：构建10-15个天然化合物合成相关的功能模块；创建若干重要天然药物的新生物合成路线，实现其在底盘细胞内异源合成，实现相关功能模块的精确调控与适配，显著提高人工细胞的生产能力。4）发表SCI论文100篇
13、, IF10的文章3-5篇。申请发明专利25-30项。5）培养80-100名博士研究生，30名左右技术骨干，20名左右学术骨干；组织3-5次国际合成生物学学术会议，形成一支在国际合成生物学领域得到同行认可、有重要影响力的研究团队。三、研究方案1、总体研究思路、项目研究的技术路线及可行性本项目的总体研究思路：针对合成生物学“模块化、工程化”构建人工生物系统的目标，本项目拟采取自上而下的设计方式，即从分析基因组、代谢网络构建模拟出发，计算和设计目标化合物合成的最优途径，进而进行合成途径上相关功能模块的解析、解耦、抽提，指导相关结构元件和调控元件的组装。另一方面，人工细胞的合成采取自下而上的构建方式
14、，即发掘、改造、或人工合成各种生物元件，将不同的结构元件和调控元件组装成具有特定功能的模块，集成相关功能模块、组建目标化合物的合成途径。在生物器件、途径、网络等各个层次上采取设计-合成-调试- 图1 本项目的学术思路再设计的循环方式，即对设计、构建出的生物器件进行定量的、工程性的表征分析，指导新一轮的设计；对模块集成进行功能测试，从而指导设计模块组装、精确调控相关模块，不断优化模块适配性；对构建出的人工细胞进行代谢组、流量组、转录组等各种组学分析，加入到代谢网络模型中，通过模拟计算提出进一步系统优化的策略。这样通过结合自上而下的设计与自下而上的构建，探索人工合成生物体的器件组装及调控的基本原理
15、与普适性规律，实现目标化学品生物合成新途径的创建（图1）。为了实现人造生物器件及集成的功能测试和优化，本项目将研究萜类和聚酮类代表性化合物（埃博霉素、紫杉醇、人参皂苷）的合成途径在底盘微生物中的重组创建。作为天然产物中最大的两类，萜类和聚酮类化合物在生物医药研究和产业中具有非常重要的地位。对这两类化合物的研究不仅对基础研究，同时将有助于推动我国相关行业的技术进步。聚酮类化合物埃博霉素和萜类化合物紫杉醇、人参皂甙都是具有独特药理活性的化合物，临床需求巨大。这些化合物来源于生长缓慢、难以大规模培养的微生物宿主（如埃博霉素来源于粘细菌）或珍稀植物宿主（如紫杉醇来源于红豆杉、人参皂甙来自于人参），通过
16、合成生物学方法获得具有明显的优势。本研究拟通过合成生物学的方法开发获得这些化合物的新途径。本项目研究的技术路线：结合设计、合成与分析，实现两大类天然产物的合成途径在底盘细胞上的组装和高效运作。图2本项目拟采取的技术途径具体而言，利用比较基因组学方法分析基因组序列，结合生化反应数据，设计目标化学品的各种潜在合成途径。利用生物信息学和计算生物学技术整合各种组学数据，建立底盘细胞的代谢网络和调控网络模型，将设计的目标产品合成途径整合到底盘细胞的网络模型中，计算各条生物合成路线的能量供给、还原力平衡、以及产物的理论产率，从而设计出目标化合物合成的最优路线，同时模拟预测网络中的重要途径及关键分支节点，提出人工细胞系统优化的策略。用图论方法对代谢途径网络的结构进行分析，建立功能模块的解耦方法。通过数学建模，模拟计算不同元件组合后的功能输出，指导基因回路和功能模块的
