b第七章动物基因工程下剖析

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1、,基因工程 第七章 动物基因工程 （下）,湖南科技大学生命科学学院,四、动物转基因的应用 研究基因的表达与功能 利用转基因动物或细胞生产生物大分子 利用转基因动物或细胞生产人体蛋白 利用转基因动物技术改良动物 五、克隆动物,第七章 动物基因工程（下）,四、动物转基因的应用,人们对于鼠的发育和遗传过程有了比较清晰的认识，同时也形成了一整套比较成熟和完善的技术。因此，有人把鼠称为哺乳动物中的“大肠杆菌”和“酵母”，是人们研究高等哺乳动物基因表达调控和发育的重要工具。 转基因鼠还可为研究人类的各种疾病，包括遗传疾病、癌症等疑难病症建立模型系统。,动物转基因的应用,完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始

2、和发展，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。帮助了解疾病的病因和发展过程。 各种人类遗传病的鼠模型，如： 老年性痴呆症(Alzheimersdisease)、 关节炎(arthritis)、 肌肉营养缺乏症(muscular distrophy)、 肿瘤发生(tumorigenesis)、 高血压(hypertension)、 神经衰变症(neurodegenenerative disorder)、 内分泌功能障碍(endocrinological disfunction)、 动脉硬化症及其他很多疾病。,（一）人类疾病的转基因动物模型,人类疾病的转基因动物模型还可用于人类病毒的研

3、究。 病毒具有一定的宿主特异性，因此很多用作模型的实验动物根本不能被人类病毒所侵染，这就给这类病毒病的研究带来了很大的困难。 转基因技术恰恰提供了解决这一难题的方法，即可将病毒的基因通过转基因技术转到实验鼠体内进行研究。,（一）人类疾病的转基因动物模型,例如，一种称为JC的人类乳多空病毒可以引起人的多病灶脑病，其主要原因是由于产生髓鞘质细胞的解体，造成髓鞘质不足，导致多种中枢神经病变。 将JC病毒基因序列转入鼠以后，转基因鼠会产生中枢神经系统病变，随着年龄的增长，中枢神经系统病变引起的震颤日益严重，同时人们发现这些鼠的中枢神经系统的髓鞘也在不断减少，由此研究人员推断JC病毒侵入人体后可以破坏中

4、枢神经系统的髓鞘生成细胞，导致中枢神经系统病变。,（一）人类疾病的转基因动物模型,基因敲除（gene knock out）是在研究基因的结构和功能常用的方法之一。由于转入基因插入染色体之后，可能会导致插入的某一内源基因而破坏该基因的功能，形成某一基因功能缺失的转基因动物。利用这种基因定向插入某一内源基因而破坏其功能的方法，来研究某一特定基因在发育过程中的功能。 人们利用胚胎干细胞法把转入基因定点整合到鼠基因组的某一位置，可以得到敲除了某一特定功能基因的转基因鼠，为这一基因的功能进行深入的研究打下了基础。,（二）利用转基因动物进行基因敲除实验,基因敲除克隆猪的产生过程,（二）利用转基因动物进行基

5、因敲除实验,转基因的插入可破坏被插入基因的正常表达，如果该基因是发育过程中具有重要作用的基因，那么相应的转基因动物就会出现畸形，因此用转基因作为探针把这一在发育过程中起重要作用的基因克隆出来。 例如：有人把鼠乳腺肿瘤病毒(mouse mammany tumor virus，MMTV)的LTR序列与鼠的c-myc基因构建成转基因。将这转基因通过显微注射转入小鼠后，一些纯合的转基因鼠出现了四肢异常，在尺骨、挠骨或胚骨、腓骨的部位只有一根骨头，而且没有关节，并且杂交实验证明LTR-c-myc转入基因与这些四肢异常的性状是紧密相关的，这表明转基因破坏了某个对四肢形成有重要意义的内源基因。,（三）转基因

6、鼠克隆在发育中起重要作用的基因,图1213 LTR-c-myc转入基因的结构及其在转基因鼠中的遗传情况,如用合适的启动子控制转基因，可使转基因只在特定类型的细胞中表达。因此设计将毒素基因置于细胞类型特异性的启动子之后，就可杀死某一类特殊的细胞，并可进一步确定缺失这类细胞的转基因鼠在发育过程中是否有异常表现，从而确定该类细胞在发育过程中的作用. 例如，弹性蛋白酶1只在胰腺的外分泌部分表达，利用弹性蛋白酶I的启动子引导毒素蛋白仅在胰腺的外分泌部分表达。晶状蛋白只在晶状体中表达，其启动子也可用于引导毒素基因在特异的细胞种类中表达。,（四）利用转基因鼠研究细胞的功能,转基因鼠可用于在乳汁中表达转基因产

7、物的表达模型系统。 例如，用囊性纤维化跨膜调节蛋白（CFTR）来研究其功能，以确定治疗囊性纤维化（CF）的可能方案。囊性纤维化是一种遗传疾病，在欧洲，大约每2500人中就有一个人一出生即患有此病。而患有这种病的人大约只能活25年。 CF基因的异常首先会影响囊性纤维化跨膜蛋白，使氯离子通道功能发生改变。当进出细胞的正常氯离子流受到破坏时，就会导致在几种器官，特别是在肺和胰腺中的导管中堆积粘液。粘液很容易成为细菌侵染的“攻击目标”，并且很难用抗生素来控制；细菌死后释放的DNA会使粘液变得更粘稠，逐渐阻塞导管，使器官正常的功能受到影响，从而加重囊性纤维化症状。,（五）转基因鼠作为外源基因的表达系统,

8、CFIR基因cDNA表达结构,（五）转基因鼠作为外源基因的表达系统,将酪蛋白基因启动子控制的CFTR基因转入鼠后，构建了携带这一基因的转基因鼠系。结果表明转基因雌鼠的乳汁中含有结合在脂肪球粒膜上的CFTR蛋白，而且转基因的哺乳母鼠与其喂养的小鼠均无不良反应。 进一步分析发现，表达的CFTR蛋白经过了糖基化，并且很容易从乳汁中富含脂肪的部分抽提出来，从奶中生产膜结合蛋白这一想法得到了科学家的肯定。,CFTR基因表达分析,（五）转基因鼠作为外源基因的表达系统,如要把哺乳动物的乳腺用作生物反应器，那么奶牛就是转基因的首选动物。每只奶牛每年能产1000L以上的牛奶，平均每千克牛奶含35g蛋白质，因此转

9、基因奶牛可以成为生产医用蛋白质的经济有效的“工厂”。,（六）转基因动物实例,1. 转基因牛,1. 转基因牛,（六）转基因动物实例,从屠宰场杀掉的奶牛体内收集卵母细胞，并使之在体外成熟； 用公牛精液对成熟卵母细胞进行体外受精； 受精卵离心，浓缩卵黄； 将欲导入的DNA微注射到精前核当中； 对胚胎进行体外培养； 利用非外科移植术将一个胚胎植入发情的代孕母牛子宫内； 对子代进行DNA检测，确定是否存在转入基因。,（六）转基因动物实例,转基因牛的制备步骤,尽管转基因牛有很好的发展前途，然而转基因牛的大量生产却进展缓慢，因为获得转基因牛比获得其他转基因动物要更加困难。一般来说，利用微注射法把外源基因注入

10、精前核时，要利用微分干涉相差显微镜differential interference contrast (DIC) microscopy才能分辨精前核；DIC显微镜能分辨羊和兔的精前核，但是难以分辨猪、牛等的精前核，还需对它们进一步进行超速离心才可能分辨出，这就增加了操作的难度。而且，从受精卵发育成小牛差不多要花费两年的时间，且牛每胎产仔的数目很少，这又进一步提高了成本。,转基因牛的技术评价,（六）转基因动物实例,对绵羊、山羊的转基因研究大多集中于利用其乳腺作为生物反应器生产药用蛋白。转基因羊比转基因牛更容易获得。 有人采用与生产转基因鼠类似的方法，构建了用乳腺特异性启动子驱动的编码人类基因的

11、载体，得到的转基因绵羊和山羊，它们都能将表达的人类蛋白质分泌到乳汁中。 转基因羊表达的转入基因编码的蛋白质是经过糖基化的，理论上讲应该同从人体内提取的蛋白质一样具有生物活性。,（六）转基因动物实例,2. 转基因绵羊、山羊和猪,利用转基因羊来生产蛋 白药 物,猪的转基因实验，以转化人的血红蛋白基因最为成功。 具体做法是：将人珠蛋白基因的调控区域与两个人l珠蛋白，一个人珠蛋白基因相连接，构建载体。得到的转基因猪在血液中表达了人的血红蛋白，人们根据各种化学标准检测发现，它们与天然的人血红蛋白性质完全相同 也许在不远的将来人们就可以用转基因动物生产的人血红蛋白来辅助输血了。,（六）转基因动物实例,转基

12、因猪,利用转基因技术改变鱼的遗传品质，作为重要的模式动物用于研究脊椎动物的发育、癌基因的功能及激素对脊椎动物的生长发育的影响等基础研究成为重要的研究目标。 要获得转基因鱼，首先要选择适当的鱼类品种作为基因的受体。迄今为止，人们已经运用微注射法向很多种鱼的受精卵中导入了外源基因，鱼类品种包括鲤鱼、鲍鱼、蹲鱼、鲑鱼和罗非鱼等。,（六）转基因动物实例,3. 转基因鱼,根据基因转化的目的不同，转基因鱼可分为3类： 一、使鱼获得某种新的有用性状； 二、使鱼丢失某种有害性状； 三、在鱼体内表达报道基因，检测启动子的活性。,（六）转基因动物实例,转基因鱼的分类,对于第一类基因而言，转入基因载体应当含有选择性

13、标记基因、目的基因、启动子或增强子及DNA复制起始位点； 如果是用于第二种目的，可以转入目的基因的反义基因，使某一特定的基因失活； 用于第三种目的的转基因鱼中常转入CAT基因和半乳糖苷酶基因等作为报道基因。,（六）转基因动物实例,转基因鱼的标记,五、克隆动物,1997年2月23日英国科学家Wilmut等人向全世界宣布，世界上第一只来源于体细胞的、通过克隆方式获得的克隆羊多莉问世了。这条消息立即在生物学和非生物学界掀起了一场轩然大波，一时间“克隆”成为各媒体乃至全社会热烈讨论的焦点。 什么是“克隆”呢? 简而言之克隆就是无性繁殖系。克隆动物是指不经过生殖细胞而直接由体细胞获得新的个体。研究人员对

14、克隆的具体定义仍然存在争议，这场争论还会持续相当长一段时间。,（一）克隆羊的诞生,由于体细胞和受精卵一样都含有全部的遗传信息，因此，从体细胞获得完整的动物个体是完全可行的。但是由于动物细胞高度分化，它是否仍然保持发育的全能性一直是学术界长期争论不休的问题。 为了证明分化后的动物体细胞是有全能性的，科学家们进行了大量的实验。最初是从胚胎细胞的核移植开始的，在成功地进行了数例胚胎细胞核移植之后，着手进行体细胞的核移植实验，研究人员发现克隆动物的成功与否取决于以下几个关键性的问题：,（一）克隆羊的诞生,1. 核移植(nuclear transplantatlon)是否成功 核移植过程中要首先分离得到

15、供体细胞和作为受体的卵细胞。卵细胞在显微镜下去核后，将单个的供体细胞注射到去核卵细胞的透明质下，在仙台病毒的介导或电脉冲作用下，两者发出融合，得到重组的卵细胞。,（二）克隆羊成功的几个关键问题,2. 要取处在适当发育阶段及细胞周期的受体和供体细胞 在哺乳动物中，已证明发育到胚胎8细胞和16细胞的卵裂球细胞可以用作核供体，而克隆绵羊多莉的诞生则表明乳腺细胞也可以用作核供体。 细胞周期也可对核移植实验产生影响。当受体细胞与供体细胞处于细胞周期中的同一时期时，核移植成功的机率最大。 Wilmut等人在研究中还发现转核实验能否成功还与细胞诱导分裂成熟的因子(MPF，maturationmitosis

16、/meiosis promoting factor)的活性有关。,（二）克隆羊成功的几个关键问题,3. 卵细胞中的大分子物质卵细胞中的大分子物质，如RNA、蛋白质等对核移植能否成功可以起决定性的作用 融合卵细胞正是在这段时间内要完成基因组的重新组织(reorganizatioon)。分化程度越高的细胞的核植入卵细胞后，其重新组织越难完成。,（二）克隆羊成功的几个关键问题,图示 多莉羊的克隆过程,克隆羊的生产过程,从理论上证明了已分化的动物细胞是具有全能性的，在适当条件下，通过基因组的重新组织就可能发育成新的个体。这对发育生物学、遗传学理论的发展必将产生重大的影响。 克隆动物技术的成熟对于动物资源的种质保存，尽可能多地保存地球生物圈内的生物多样性具有重要意义。 克隆动物对培育优良物种也有重要的意义。爱丁堡药物蛋白有限公司之所以会投资资助克隆羊项目是因为转基因技术与克隆技术相结合可以快速培育出能生产人类所急需的蛋白质药物的优良品种。 克隆动物至少可以从生产移植器官，培育优良畜禽品种，利用动物作为生物反应器生产药物和提供实验动物等几