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1、 ICS65.120B 46DB37山东省地方标准DB 37/T XXXXXXXXX饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法XXXX - XX - XX发布 - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布 目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 原理14 试剂或材料15 仪器设备26 样品27 试验步骤27.1 提取27.2 浓缩27.3 液相色谱参考条件37.4 标准系列溶液37.5 测定38 试验数据处理38.1 维生素A乙酸酯含量38.2 维生素D3含量48.3 维生素E乙酸酯含量59 精密度5附录A （规范性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸
2、酯标准溶液浓度校正方法6附录B （资料性附录） 维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯标准溶液的高效液相色谱图7前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省饲料质量检验所、青岛市华测检测技术有限公司。本标准主要起草人：强莉、吕明春、刘雪芹、李斌、宫玲玲、李俊玲。 饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法1 范围本标准规定了饲料中维生素A乙酸酯、维生素D3、维生素E乙酸酯测定的高效液相色谱方法。本标准适用于复合预混合饲料、维生素预混合饲料中维生素A乙酸酯、
3、维生素D3、维生素E乙酸酯的测定。其他饲料可参照执行。本方法定量限：维生素A乙酸酯为10 000 IU/kg；维生素D3为40 000 IU/kg；维生素E乙酸酯为100 mg/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1饲料采样GB/T 20195动物饲料试样的制备3 原理试样中的维生素A乙酸酯、维生素D3和维生素E乙酸酯用二甲基亚砜(DMSO)超声溶解，经正己烷萃取、浓缩、复溶后，供高
4、效液相色谱仪测定，外标法定量。4 试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.1 水：GB/T 6682，一级。4.2 正己烷。 4.3 二甲基亚砜（DMSO）：色谱纯。4.4 甲醇：色谱纯。4.5 维生素A乙酸酯标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素A乙酸酯标准品（CAS：127-47-9，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱保存，有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.6 维生素D3标准储备溶液（1 mg/mL）：称取维生素D3标准品（CA
5、S：67-97-0，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.7 维生素E标准工作溶液（1 mg/mL）：称取DL-生育酚乙酸酯标准品（CAS：7695-91-2，纯度不低于99.0 %）50 mg(准确至0.01 mg)于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇(4.4)溶解定容。置-18 冰箱避光保存。有效期为3个月。临用前利用紫外分光光度计检测其吸光度值，计算其准确浓度。（校正方法见附录A）。4.8 维生素A标
6、准工作液：准确吸取1.00 mL的维生素A标准储备液（4.5）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素A标准工作液浓度为100 g/mL。于-18 保存，有效期为半个月。4.9 维生素D3标准工作液：准确吸取0.50 mL维生素D3标准储备液（4.6）于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。维生素D3标准工作液浓度为50 g/mL。于-18 保存，有效期为半个月。4.10 析相分离纸：1 PS。4.11 微孔滤膜：0.22 m，有机相。5 仪器设备5.1 高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。5.2 电子天平：感量为0.1 mg和0.01 mg。5.3 紫外分光
7、光度计。5.4 超声波振荡器。5.5 振荡器：频率不低于250次/min。5.6 旋转蒸发器。5.7 氮吹仪。5.8 平底烧瓶（具塞）：棕色500 mL。6 样品按GB/T 20195制备试样，取不少于250 g样品，全部过1.0 mm孔径分析筛，筛上物不大于3 %，混合均匀后，装入密闭容器中，于28 避光保存。7 试验步骤7.1 提取平行做两份试验。称取试样13 g(准确至0.1 mg)，置于500 mL平底烧瓶中，加30 mL的DMSO（4.3），在超声波水浴中超声提取30 min（水温不宜超过35度；中间旋摇23次以防样品附着瓶底）；取出放置冷却。注： 在加入DMSO的过程中，小心试样结
8、块。先倒入少许DMSO，振摇烧瓶，将试样摇匀，再将剩余DMSO沿烧瓶壁冲洗，使附着在内壁的试样全部冲洗到烧瓶的底部。待冷却至室温后，准确加入100 mL正己烷（4.2），加盖、剧烈振摇（频率250次/min）15 min，静置分层后再次准确加入100 mL正己烷（4.2），重复提取一次，静置；待正己烷层变澄清透明，且中间乳化层消失以后，将全部正己烷层萃取液经析相分离纸过滤，待测。7.2 浓缩准确移取一定体积的滤液（依据样品标示量、称样量和提取液用量确定分取量）置于旋转蒸发器烧瓶中，在不超过40 条件下缓慢真空蒸发至近干或直接用氮气吹干。残渣用甲醇（4.4）溶解，并稀释至10 mL，使获得的溶液
9、中每毫升含维生素A为20 IU50 IU、维生素D3为300 IU400 IU、维生素E为200 g300 g，过0.22 m微孔滤膜，待测。7.3 液相色谱参考条件色谱柱：C18，长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 m，或性能相当者。柱温：30 ；进样量：10 L；流动相：甲醇+水=97+3；流速：1.0 mL/min；检测波长：维生素A乙酸酯 325 nm；维生素D3 264 nm；维生素E乙酸酯 285 nm。7.4 标准系列溶液7.4.1 维生素A标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.8)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.50 g/mL
10、、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL、8.0 g/mL、10.0g/mL、20.0 g/mL。现用现配。7.4.2 维生素D3标准系列溶液：准确移取适量标准工作液(4.9)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：0.20 g/mL、0.50 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL、5.0 g/mL、8.0 g/mL、10.0 g/mL。现用现配。7.4.3 维生素E标准系列溶液：准确移取适量标准工作溶液(4.7)于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为：20.0 g/mL、40.0 g/mL、80.0 g/mL、
11、100.0 g/mL、200.0 g/mL、300.0 g/mL、500.0 g/mL。现用现配。7.5 测定按照7.3给出的色谱参考条件，依次上机测定标准系列溶液和试样溶液。试样溶液与标准溶液中维生素A、维生素D3和维生素E的保留时间相对偏差在2.5 %之内。在仪器线性之内范围，以维生素A、维生素D3和维生素E的浓度为横坐标，以其响应值（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线相关系数不低于0.99。单点校准时，试样溶液与标准溶液中待测物的响应值相差不超过30 %。如超出线性范围，应用甲醇稀释（n倍）后，重新进样分析。维生素A、维生素D3和维生素E标准溶液图谱参见附录B.1B.3。8 试验数
12、据处理8.1 维生素A乙酸酯含量8.1.1 试样中维生素A乙酸酯的含量1质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（1）计算：1=P1V1P2mf1n11000(1)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n1 稀释倍率；1维生素A乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P1 试样溶液峰面积值；P2 维生素A乙酸酯标准工作液峰面积值；f1 转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 g维生素A乙酸酯。8.1.2 试样中维生素A乙酸酯的含量1质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，多点校准按式（2）计算：1
13、=c1Vmf1n11000(2)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n1 稀释倍率；c1 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；f1 转换系数，1国际单位（IU）相当于0.344 g维生素A乙酸酯。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。8.2 维生素D3含量8.2.1 试样中维生素D3含量2质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（3）计算：2=P3V2P4mf2n21000(3)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n2 稀释倍率；2维生素D3标准
14、工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P3 试样溶液峰面积值；P4 维生素D3标准工作液峰面积值；f2 转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 g胆钙化醇。8.2.2 试样中维生素D3含量2质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，多点校准按式（4）计算：2=c2Vmf2n21000(4)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n2 稀释倍率；c2 由标准曲线查得试样中待测物色谱峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；f2 转换系数，1国际单位（IU）维生素D3相当于0.025 g胆钙化醇。平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字。8.3 维生素E乙酸酯含量8.3.1 试样中维生素E乙酸酯含量3质量分数国际单位（或毫克）每千克（IU或mg/kg）表示，单点校准按式（5）计算：3=P5V3P6mf3n3(5)式中：m 试样质量，单位为克（g）；V 定容体积，单位为毫升（mL）；n3 稀释倍率；3维生素E乙酸酯标准工作液浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；P5 试样溶液峰面积值；P6 维生素E乙酸酯标准工作液峰面积值；f3 转换系数，转换系数，1国际
