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1、重要生物药物制造工艺,E-mail：xinmigwy Tel：3831677,发酵工程教研室 郭伟云,第 三 篇,1,本门课程由以下三大部分内容组成,2,生物药物的类别,（一）天然生物药物 1.微生物药物 microbial medicine 2.天然生化药物 Biochemical medicine 3. 海洋生物药物 marine medicine,（二）生物技术药物（新生物制品） 1.DNA重组药物（DNA recombinant medicine）基因工程与蛋白质工程药物 2. 基因药物,（三）合成或半合成生物药物,3,1.迅速被体内酶降解 2.肾小球过滤清除 3.抗原抗体反应 4.溶
2、解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,体外聚乙二醇修饰（PEG化）,(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤 (2)阻碍蛋白酶的降解作用 (3)屏蔽药物的免疫位点 (4)增加药物在体液中的溶解度 (5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH3(-O-CH-CH)n-OH,修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延长半衰期 修饰人肿瘤坏死因子 消除副作用 修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期 修饰牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗肿瘤活性 修饰超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期 修饰天冬酰氨酶（Aspartase） 克
3、服免疫原性 提高半衰期 修饰人干扰素（IFN） 提高半衰期 修饰血红蛋白（Hb） 血液代用品 修饰胰岛素 提高半衰期,我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作,生化药物制造工艺,第 十 三 章,7,生化药物的定义、分类、特点,定义：具体运用生物化学研究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新的活性物质，通称生化药物（Biochemical medicine）。,8,重点,分 类,9,维生素类药物,生化药物的特性,1药理学特性：,药理活性高，针对性强,毒副作用少，营养价值高,生理副作用常有发生 免疫原反应，过敏反
4、应,10,生化药物的特性,2理化特性：,11,3天然生物药物是新型药物的先导物,通过合理的药物设计，可以创造出疗效更高，作用更专一，更易为机体接受，副作用与不良反应更小的新药。,12,有机溶剂分级分离、等电点沉淀等 -粗提物。,离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术 -提高了产品的纯度和收率,多种层析技术、超速离心等 -高纯度的生化药物,13,生化药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,14,主要从以下脏器中制取生化药物,15,毒蜥,Exendin-4是自毒蜥唾液中提取的一种多肽，研究发现该多肽与人体内的GLP-1在序列上有53的同源性，同GLP-
5、1一样具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛细胞等作用。2005年经FDA批准用于二型糖尿病的治疗。Exenatide是Exendin-4的人工合成品。,Exenatide,16,麻省Transmolecular公司的科学家将放射性I131附着于自蝎子毒液中提取的一种多肽制成药物，研究发现该药物具有靶向性，对晚期神经胶质瘤有较好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。,蝎 毒 肽,17,生物药物的资源,植 物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,18,利用微生物作为工具,微生物的代谢物,微生物菌体,19,生物药物的资源,植
6、物,动 物,动物脏器血液、分泌物及其它代谢物,微 生 物,海 洋 生 物,20,海藻类：已知的海藻有1万多种,海洋动物类：腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,海洋微生物：,21,僧袍芋螺,齐考诺肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一种神经细胞钙通道阻断剂。作为一种非阿片类镇痛药物，用于治疗严重的慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经FDA批准于2005年上市。,齐考诺肽（ziconotide）,22,DidemninB是一种由7个氨基酸和2个羧酸组成的带有分枝的环缩肽，既能抑制蛋白质的合成,也能抑制DNA、RNA的合成，对黑色素瘤B16
7、细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各期细胞，尤以G1至S期细胞敏感，它可快速完全介导HL-60细胞凋亡。目前Didemin B已能够人工全合成。,海鞘来源的抗癌肽 Didemnin B,23,海兔体内存在着多种结构独特、生理功能各异的次生代谢产物，如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等，其中肽类化合物尤为引人注目。其中Dolastatin15和Dolastatin 10主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。,海兔来源的抗癌作用肽,24,海藻类：已知的海藻有1万多种,海洋动物类：腔肠动物类、节肢 动物类、软体动物类、鱼类、爬行动 物类、海洋哺乳动物类,海洋微生物：,25,第一
8、节 氨基酸类药物,26,本节内容,氨基酸的种类,氨基酸类药物的制造方法,27,氨基酸输液,氨基酸的分类,蛋白质氨基酸：编码氨基酸,非蛋白氨基酸：D型氨基酸、-氨基酸、-氨基酸等,衍生氨基酸：5-羟色胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等,必需氨基酸和非必需氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。,28,29,八种必需氨基酸：携一两本黄色书来,携-缬氨酸 一-异亮氨酸 两-亮氨酸 本-苯丙氨酸 黄-甲硫氨酸（硫为黄色） 色-色氨酸 书-苏氨酸 来-赖氨酸,氨基酸记忆口诀,30,六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋半胱、光、蛋（甲硫）氨酸含硫氨基酸 酸谷天出门：酸、谷、天谷氨酸、
9、天门冬氨酸酸性氨基酸 死猪肝色脸：丝、组、甘、色氨酸一碳单位来源的氨基酸 只携一两钱：支、缬、异亮、亮缬、异亮、亮氨酸支链氨基酸 一本落色书：异、苯、酪、色、苏异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸生糖兼生酮 拣来精读之：碱、赖、精、组赖氨酸、精氨酸、组氨酸碱性氨基酸 芳香老本色：芳香、酪、苯、色酪、苯丙、色氨酸芳香族氨基酸 不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸不参与转氨基的氨基酸,所有氨基酸： 六伴穷光蛋， 酸谷天出门， 死猪肝色脸， 只携一两钱。 一本落色书， 拣来精读之。 芳香老本色， 不抢甘肃来。,发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、
10、亮氨酸等,酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等,氨基酸类药物的制造方法,重点,31,基本原理：,以毛发等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。,* 主要过程：水解、分离和结晶精制。,32,蛋白质水解法,品种：L-胱氨酸、L精氨酸、L亮氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸及L-丝氨酸等。,酸水解法：水解迅速而彻底，无消旋作用；色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基，且产生大量废液污染环境。 碱水解法：水解迅速而彻底，色氨酸不被破坏；含羟基或巯基的氨基酸全被破坏，且产生消旋，工业上多不采用。 酶水解法：反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸
11、不被破坏，无消旋作用；水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含有多肽。工业上主要用于生产水解蛋白及蛋白胨。,蛋白质水解法,重点,33,发酵的基本原理 借助微生物在有氧或无氧条件下进行生命活动制备微生物菌体或其代谢产物的过程。,发酵法,34,菌种诱变与选育,种子制备,发酵培养,产物分离纯化,发酵的基本过程,35,培养基配制与灭菌,缺点 产物浓度低，设备投资大，生产周期长，成本高。,*绝大部分氨基酸可通过发酵法生产，有些由于得率低，未实现工业化生产。,36,基本原理：,又称酶工程技术，是在特定酶的作用下使某些有机物转化成相应氨基酸的技术。,* 主要过程,前体合成,菌体培养,转化反应,产品纯化与精制,酶转
12、化法,37,微生物 植物细胞 动物细胞,化学合成，生物合成，天然存在,底 物 （AA前体）,生物反应器,含L-AA反应液,L-AA,酶转化法生产L-AA流程,38,133.10,89.09,2.77,6.0,酸性氨基酸,中性氨基酸,溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚,在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚,39,酶转化反应,工艺路线,40,工 艺 路 线,41,* 优点 工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可反复使用。,* 缺点 固定化细胞或固定化酶代价高。,42,以酸、醛、酯及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩和、取代及氢化还原等化
13、学反应合成-氨基酸的方法称为化学合成法。,化学合成法,43,* 特点 理论上所有氨基酸均可由化学合成法制造，但只有当采用其他方法生产很不经济时才采用化学合成法生产。,44,2005版中国药典收载的氨基酸原料药,氨基酸输液,45,氨基酸输液 多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称为氨基酸输液。 当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。,氨基酸输液的组方原理与配方模式,46,不同类型的AA输液，根据在临床上的用途不同 可以分为以下几类：,47,思考题,氨基酸类药物的制造方法有哪些？简述其原理及其过程？ 蛋白
14、质水解法有哪些？各有何优缺点？,48,第二节 多肽与蛋白质类药物,49,本节内容,多肽与蛋白质类药物概述,多肽与蛋白质类药物的制造方法,50,重要的多肽与蛋白质类药物的制备,51,多肽类药物分类,52,多肽类药物分类,53,蛋白质类药物分类,54,蛋白质类药物分类,55,化学合成法,基因工程法,多肽与蛋白质类药物的制造方法,重点,56,原料选择,蛋白质药物Separation and Purification,57,重点,Protein-Separation,原料选择,提取,58,重点,清蛋白 可溶于稀盐、稀酸、稀碱。 可被饱和硫酸铵沉淀。 eg:白蛋白，卵清蛋白,球蛋白 不溶于水但溶于稀盐，
15、可以被 半饱和的硫酸铵沉淀。 eg: IgG，肌球蛋白,谷蛋白 不溶于水、醇和中性盐溶液， 但溶于稀酸或稀碱。 eg:米谷蛋白,谷醇溶蛋白 不溶于水及无水乙醇，但溶于 70-80%乙醇中。非极性侧链多 eg:小麦醇溶蛋白,组蛋白 溶于水和稀酸，但可被稀氨水 沉淀，分子中含His、Lys多。 eg:小牛胸腺组蛋白,鱼精蛋白 溶于水及稀酸，不溶于氨水， 分子呈碱性。 eg:鲑精蛋白,硬蛋白 不溶于水、稀酸、稀碱、盐。 有较强机械强度。 eg:角蛋白，胶原,Protein-Purification,纯化 根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。 1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有： 1）pI
16、沉淀法 2）pI沉淀法与盐析法相结合 3）等电聚焦法 2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有 1）凝胶过滤 2）超滤法 3） 离心法 4）透析法 3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有： a)盐溶与盐析法 b）结晶法 c）有机溶剂沉淀法 4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法 5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法 6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法 7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法 8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化,60,重点,蛋白质两性解离性质和等电点,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）,等电聚焦电泳（Iso
