b第三章目的基因导入细胞剖析

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1、,基因工程 第三章 目的基因导入细胞,3.1 目的基因,基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出可用于克隆的此类基因。这样的基因通常称这目的基因。目的基因主要是结构基因。,3.1.1 结构基因组成,作为一个能转录和翻译的结构基因必须包括转录启动子、基因编码区和转录终止子。 启动子是DNA上RNA聚合酶识别、结合和促使转录的一段核苷酸序列。转录mRNA的第一个碱基被定为转录起始位点，这个碱基多数情况下是A，以此作为序列的+1，其上游的核苷酸序列为“-”，下游的核苷酸序列为“+”。基因编码区包括起译码ATG、开读框和休止

2、码TAA（或TAG、TGA）。 终止子是一个提供转录停止信息的核苷酸序列。不同类型基因组的基因组成稍有不同，因此必须根据基因组类型和实验需要来分离含目的基因的DNA片段。,3.1.1.1 原核生物结构基因的组成,原核生物的基因多数以操纵子形成存在。完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个启动子的调控之下，下游同具一个终止子，但各基因分别有起译码ATG和休止码TAA（或TAG、TGA）。 操纵子除启动子外，往往还有一些调控转录的其他因子，如乳糖操纵子除启动子（p）外，还有调节因子（i）和操纵因子（o）。,原核生物基因在起译码ATG上游约10bp处，有一个富含嘌呤核苷酸的SD保守序列区，一般为

3、AGGA，由此区转录的序列是翻译时核糖体识别、结合mRNA的位置。核糖体由此位置向前移动，寻找起译码AUG。 原核生物基因转录终止之前有一段回文序列结构，称为终止子，使RNA聚合酶减缓移动或停止RNA的合成。但不是所有回文序列结构都是终止子。,3.1.1.2 真核生物结构基因的组成,真核生物染色体基因组的基因是单独存在的，并且两个基因之间有很长的间隔序列区，甚至起译码与休止码之间除编码序列区外还有一至多个非编码序列间隔区，称为内含子，而编码序列区称为外显子。,真核生物结构基因的转录启动子通常包含3个保守序列区：在-20至-30序列区有一个TATA框，DNA双链在此外开始解开；在-75序列区有一

4、个CAAT框，其作用是与RNA聚合酶结合有关；在更上游处有一个GC框，是某些转录调控因子结合的序列。 对真核生物基因转录的终止信号和终止过程了解甚少。不过发现高等真核生物结构基因休止码序列下游有一保守的AATAAA序列提供转录产物的释放信号。 此外，真核生物染色体基因组的结构基因不具SD序列区，核糖体与转录的mRNA结合靠mRNA5端添加的“帽”结构。,3.1.2 分离目的基因的途径,根据实验需要，待分离的目的基因可能是包含转录启动区、基因编码区和终止区的全功能基因，甚至是一个完整的操纵子或由几个功能基因、几个操纵子聚集在一起的基因簇；也可能是只具基因的编码序列，甚至是只含启动子或终止子等元件

5、的DNA片段；不同基因组类型的基因大小和基因组成也各不相同。 因此分离目的基因应采用不同的途径和方法。,3.1.2.1 通过构建cDNA文库和基因组文库分离 目的基因,通过转录和加工，每个基因转录出相应的一个mRNA分子，经反转录可产生相应的cDNA（complementary DNA，互补DNA）。这样产生的cDNA只含基因编码序列，不具启动子和终止子以及内含子。,3.1.2.1 通过构建cDNA文库和基因组文库分离 目的基因,某生物基因组经转录和反转录产生的各种cDNA片段分别与合适的克隆载体连接，通过转导（转化）贮存在一种受体菌的群体之中。把这种包含某生物基因组全部基因cDNA的受体菌群

6、体称为该生物cDNA文库。如果此群体只贮存某生物基因组的部分基因的cDNA，则称为部分cDNA文库。随后通过分子杂交等方法从cDNA文库中钓出含目的基因的菌株。 用此方法获得的目的基因只有基因编码区，进行表达还须外加启动子和终止子等调控转录的元件。,在生物体中，某种基因转录的mRNA在不同组织和不同发育时期的细胞内的丰度往往是不同的。mRNA丰度越高的基因越容易得到。因此为了获得某种目的基因，必须选用含这种目的基因的mRNA丰度高的组织来构建cDNA文库。,包含某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这个群体称为这种生物的基因组文库。 同样可以通过

7、分子杂交等方法从基因组文库中钓出目的基因。,构建基因组文库的途径基本上与cDNA文库相似，主要区别是用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切，产生一系列大小不等的DNA片段，再与合适的克隆载体连接，转导或转化受体菌。 这样构建的基因组文库中，有的受体细胞克隆了含有转录整套调控因子的全功能基因，甚至含有整个操纵子或基因簇；有的可能只克隆了启动子、或终止子、或基因编码区、或它们的一部分，甚至只是间隔序列。,为了能克隆含有完整的全功能的基因或操纵子的大片段DNA，一般采用cosmid载体。因为cosmid载体可以承载30kb左右的较大外源DNA片段。 如果已知目的基因的分子大小，或已知待克隆的D

8、NA片段大小范围，则可先通过基因组DNA酶切片段的凝胶电泳，回收大于待克隆的DNA片段，构建部分基因组文库，可以减少从文库中钓出目的基因的工作量。 为了从cDNA文库和基因组文库中钓出目的基因，如果已经分离得到目的基因表达的蛋白质，那么可以先测定蛋白质的氨基酸序列，再根据氨基酸序列确定核苷酸序列，人工合成探针，同文库中的菌落或噬菌斑进行原位杂交，有明显杂交信号的菌落或噬菌斑就含有目的基因。,3.1.2.2 用PCR技术从基因组中扩增出目的基因,PCR（polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应）是以DNA的一条链为模板，在多聚酶的催化下，通过碱基配对使寡核苷酸引物向3

9、方向延长合成模板的互补链。PCR包括3个反应过程：双链DNA变性（9095）成为单链DNA、引物复性（3760）同单链DNA互补序列结合、DNA聚合酶催化（7075）使引物延伸。这三个基本步骤重复进行，可以使特异性DNA的扩增率达到数百万倍（2106）。该过程见图2-10。 如此经过2530次循环，产生大量待扩增的特异性DNA片段，足够用于进一步实验和分析。,图2-10 PCR反应过程的原理,PCR是目前分离筛选目的基因的一种有效方法。若已知目的基因两侧的20个以上的核苷酸序列，则可设计和人工合成一对寡核苷酸引物，扩增出含目的基因的DNA片段。,3.2 目的基因导入受体细胞,目的基因能否有效地

10、导入受体细胞，取决于是否选用合适的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法。,3.2.1 受体细胞,所谓基因克隆的受体细胞，是能摄取外源DNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。 原核生物细胞是一类很好的受体细胞，容易摄取外界的DNA，增殖快，基因组简单，便于培养和基因操作，普遍被用作cDNA文库和基因组文库的受体菌，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或者作为克隆载体的宿主。目前用作基因克隆受体的原核生物主要是大肠杆菌，蓝藻和农杆菌等也被广泛应用。,真核生物细胞

11、作为基因克隆受体近来已受到很大的重视，如酵母和某些动植物的细胞。 由于酵母的某些性状类似原核生物，所以较早就被用作基因克隆受体。 虽然动物细胞也已被用作受体细胞，但由于体细胞不易再分化成个体，所以采用受精卵细胞或胚细胞作为基因转移的受体细胞，由此培养转基因动物。 植物细胞作为基因克隆的受体细胞，有其优于动物细胞的特点，一个活的离体体细胞在合适的培养条件下比较容易再分化成植株，意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养成能传代的植株，成为转基因植物。由于这个原因，近年来植物基因工程发展非常迅速。,3.2.2 目的基因片段组入克隆载体,目的基因导入受体细胞之前，一般须先把含目的基因的DNA片段组入合适

12、的克隆载体。 为选用合适的克隆载体，必须注意以下几点： 为了使组入的目的基因能够在受体细胞中有效表达，应选用具强启动子的表达载体，除非目的基因本身已具备在受体细胞内有功能的强启动子。 选用的克隆载体便于同含目的基因的DNA片段进行连接。 根据确定的受体系统，选用相应的克隆载体，因为用作受体细胞的不同生物类型有各自适用的克隆载体。随着基因转移方法的不断发展，原来不能用于某种受体细胞的克隆载体，由于采用电击仪和基因枪等新的基因转移方法成为可用的载体。,有时当克隆载体确定后，为了使含目的基因的DNA片段能组入克隆载体，往往还须对DNA片段末端进行适当的加工。 根据实验设计，有了合适的克隆载体和含目的

13、基因的DNA片段，则选用限制性内切酶切割，并用DNA连接酶连接，得到预期的重组DNA分子。,3.2.3 重组DNA分子导入原核生物细胞,大肠杆菌是用得最广泛的基因克隆受体，可以通过转化、转导和三亲本杂交等途径，把重组DNA分子导入受体细胞。,3.2.3.1 转化途径,携带基因的外源DNA分子通过与膜结合进入受体细胞，并在其中稳定维持和表达的过程称为转化（transformation）。DNA转化大肠杆菌的技术路线包括制备感受态细胞和转化处理。 感受态细胞指处于能摄取外界DNA分子的生理状态的细胞。为制备感受态细胞，在最适培养条件下培养受体菌至对数生长后期，离心收获菌体，将其悬浮在含CaCl2（

14、50100mmol/L）的无菌缓冲液中，置冰浴中15min后，离心沉淀，再次悬浮在含CaCl2的缓冲液中，4下放置1214h，便成为可用于转化的感受态细胞。,转化过程： 向新制备的感受态受体细胞悬浮液中加入重组DNA溶液，使CaCl2终浓度为50mmol/L，置于冰水浴中1h左右，转移至42水浴中放置2min，促进受体细胞吸收DNA，马上转移到37水浴中培养5min，加入适量LB培养基，37振摇培养3060min，就可以接种在选择培养基上筛选克隆子。,3.2.3.2 转导途径,通过噬菌体（病毒）颗粒感染，把DNA导入被感染的受体细胞的过程称为转导（transduction）。 含目的基因的DN

15、A与噬菌体（病毒）载体的重组DNA分子导入受体细胞，一般先须进行体外包装。为此，根据噬菌体体内包装的原理，获得了分别缺D蛋白和E蛋白噬菌体突变株的两种溶源菌。这两种溶源菌单独培养，因各缺一种包装必备的蛋白质，所以体内即使有DNA也不能进行包装，因此细胞内积累了大量除一种以外的其他供包装用的蛋白质。如果在试管内混合两种溶源菌合成的蛋白质，D蛋白和E蛋白互相补充，就可以包装DNA或重组的DNA。 其主要过程举例如下：,（1）制备包装用蛋白质 培养溶源菌BHB2690（D蛋白缺失）和BHB2688（E蛋白缺失）至对数生长中期，诱导溶菌生长，混合两种培养物，离心沉淀，悬浮于合适的缓冲液中，快速分装（每

16、管50l），置于液氮中速冻，贮存于-70冰柜，6个月内有效。 （2）体外包装 取包装物（50l）置于冰浴上升温，当其正要融化时加入重组的DNA，边融边搅，充分混匀后，置于37保温60min，加入少量氯仿，离心沉淀杂物。上清液中含有新包装的噬菌体颗粒，就可用来感染受体细胞，筛选克隆子。,3.2.3.3 重组DNA分子通过亲本杂交转化大肠杆菌,当重组DNA分子不能直接转化受体菌时，可采用三亲本杂交（triparental mating）转化法。被转化的受体菌、含重组DNA分子的供体菌和含广泛宿主辅助质粒的辅助菌三者进行共培养，在辅助质粒的作用下，重组DNA分子被转移到受体菌细胞内，按照重组DNA分子携带的选择标记筛选克隆子。 外源DNA通过上述3种方法导入大肠杆菌 的技术已趋于成熟。其中有的方法经洗染修改可以用于蓝藻、固氮菌和农杆菌等其他原核生物的基因转移。,3.2.4 重组DNA分子导入真核生物细胞,由于核核生物的细胞结构较为复杂，适用于原核生物基因转移的方法不能有效地用于真核生物。因此，近年来经过探索，发展了多种适用于