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1、第三章 细胞生物学研究方法,第一节 细胞形态结构的观察方法,一、普通光学显微镜和特殊光学显微镜,普通光学显微镜（A）和荧光显微镜（B）的光路图,A. 标本的制备（Preparation of specimen）,B. 分辨率和放大倍数（Resolution and magnification）,分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 放大倍数=目镜的放大倍数物镜的放大倍数,光镜Dmax0.2um,C. 特殊光学显微镜技术,荧光显微镜技术（fluorescence microscopy） 激光扫描共焦显微镜技术(laser scanning confocal microscope） 荧光漂白恢复
2、技术（fluorescence recovery after photobleaching） 相差显微镜和微分干涉差显微镜（Phase-contrast microscope and Differential-interference microscope）,荧光显微镜（fluorescence microscopy）,化学性质的荧光染料：rhodamine 罗丹明 fluorescein荧光素 经荧光染料标记的抗体：借“抗原抗体”结合，特异性地显示观察物 绿色荧光蛋白（GFP ）,A.激光束（光源）经双色镜反射后，通过物镜汇聚到样品某一焦点； B.从焦点发射的荧光（样品一般须经免疫荧光标记）
3、经透镜汇聚成像，被检测器检出； C.通过样品其它部位的激光发出的荧光不会聚焦成像，因而检测器不能检出。 用于活体动态，结构-功能，动态-静态，定位-定量-定性研究等。,激光扫描共焦显微镜 （Laser scanning confocal microscope）,(a)普通荧光显微镜细胞有丝分裂（纺锤体）(b)激光共聚焦显微镜,A普通荧光果蝇胚胎B共聚焦,昆虫神经系统当中的部分 绿色荧光蛋白跟神经元中的一个蛋白做成融合蛋白然后用转染的方法让昆虫的胚胎发育，因此它的神经细胞中表达的蛋白是具有绿色荧光蛋白作为报告蛋白的。,荧光漂白恢复技术（FRAP）,可用以证明：一个活细胞它的细胞表面质膜中的一些蛋
4、白是可以作侧向运动的。,相差显微镜和微分干涉差显微镜（Phase-contrast microscope and Differential-interference microscope）,因标本密度不同，光线经过时光波相位发生改变，相位改变代表光波振幅改变，而振幅改变代表光线明暗变化，振幅越大光越亮。 普通光镜染色切片是因染料分布不均，各部分厚薄不均，染料沉积不均，对光波吸收不均，因而改变的是光波波长从而使颜色发生改变。,To visualize unstained living cells,相位板,环形光阑,光程差转变为振幅差,微分干涉差显微镜用于观察未染色的玻片标本。,1-2 电子显微镜
5、,光镜分辨极限为0.2um，小于0.2um的微细结构的光波可产生衍射现象，这种光波经过物体时可绕过物体就像无物体经过一样，因此无法用光镜观察。这就需要一种更大分辨率的仪器来观察比0.2um更小的物体的细微结构。,1-2 电子显微镜,电子波长比光波短得多，用电子波代替光波可提高显微镜的分辨力。电镜就是根据这样的原理产生的。,A.电镜与光镜的基本区别,B.电子显微镜分辨率,电子显微技术中的常用度量单位是埃( =0.1nm)。 电子显微镜的分辨极限是2个埃，相当于金属中相邻两个原子之间的距离。,C.电镜的历史,1938年，Ruska生产出第一台透射电镜。,1935年，法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思
6、想和工作原理。 1942年剑桥大学的马伦首次制成世界第一台扫描电镜。,D.电子显微镜的分类,透射电镜（TEM）,扫描电镜（SEM）,透射电镜 （Transmission electron microscope, TEM）,原理: 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。 分辨力：0.2nm，放大倍数可达百万倍。 用途：用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopic
7、structures）。,透射电镜（TEM） 成像原理,生物分子由原子序数低的轻元素组成，他们散射电子能力弱，在电镜下几乎不存在明暗反差，为加大生物样品反差，进行染色。常用染色剂：醋酸钠，枸橼酸铅。,透射电镜（TEM） 标本制备过程,为防止生物样品在死亡后和脱水过程中产生结构改变，离体生物标本迅速固定。常用戊二醛和四氧化锇固定。戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键，将它们交联在一起。四氧化锇除与蛋白共价结合外，还对脂类有良好的固定效果。,标本必须置于高真空中进行电镜观察，但电镜不能观察含水的生物标本，需经脱水处理。另外由于包埋剂与水不溶，用脱水剂可将组织中游离水脱去，利于包埋。,为使柔软生物组织制
8、成超薄切片，并使切片耐受高真空、电子轰击，则在切片前将标本进行包埋，常用环氧树脂。,电子穿透力很弱，需将样品制成50-100nm厚的薄片。,尽可能保持生活状态，避免损伤，必须耐真空。由于电子穿透力弱，标本必须超薄。标本反差应尽可能大（生物材料原子系数低,图像反差小，不易出现明暗差别）。,透射电镜（TEM） 提高样品反差的方法,负染法（negative staining） 将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上，滴加磷钨酸，样品干燥后重金属盐沉淀于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比，这种只染背景而不染样品的方法叫负染 。,肌动蛋白丝负染电镜图,球形分子组成的螺
9、旋链,真空镀膜法（metal shadowing） 把铂或钯等重金属接受高温蒸发，金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜，膜的厚度反映了样品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。,透射电镜（TEM） 提高样品反差的方法,把标本用液氮超低温冷冻，低温真空中割断，升温使冰升华，细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷，膜和其它一些结构显露出来，增强了断面的浮雕效果蚀刻。 标本蚀刻后以45喷金，90喷碳后将组织用腐蚀液溶解掉，只剩下碳-金属膜就是复型。捞于载网上干燥后将复型膜置于透射电镜下观察，可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。,透射电镜技术冷冻蚀刻(freeze etching
10、),冷冻,断裂,蚀刻,复型,剥膜,肌动蛋白纤维经冷冻蚀刻复型技术得到的影像。,A Yeast Cell,扫描电镜 （Scanning electron microscope, SEM）,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。 分辨力：为610nm，约为人裸眼分辨力的2万倍。 原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,扫描电镜技术（
11、SEM）成像原理,SEM of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A) .For comparision, the same structure is shown by differential-interference-contrast light microscopy (B) and by thin section electron microscopy (C).,扫描电镜照片展示,疟疾破坏的两个红细胞,扫描电镜照片展示,扫描电镜的特点,很强的立体感,高的分辨率,应用范围广
12、,放大倍率可调,生物样品与金属、矿物等材料不同，它具有质地柔软、容易变形、导电性能差、二次电子发射率低以及含水量多（有的含水量达80%）等特点。因此，在处于高真空状态下的扫描电镜内观察生物样品时，必须严格地遵循一定的原则和操作程序，对样品进行必要的预处理。,扫描电镜生物样品的制备,每一步处理步骤及操作过程中，都应注意防止对样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能地保持原有形貌及微细结构。 去除样品内的水分，以利于维持SEM的真空度和防止对镜筒的污染，但在脱水和干燥处理时，要尽量避免和减少样品体积变小、表面收缩变形等人工损伤。 降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适
13、当的反差和减少样品的充放电效应。 无论观察组织、细胞的表面或内部微细结构，都应注意辨认和保护观察面。,扫描电镜生物样品的制备基本原则,扫描电镜生物样品的制备基本程序,临界点干燥(Critical-point drying, CPD),临界点干燥，是根据物质存在着临界状态的物理特性而研制的。在温度和压力的变动之下，任何物质存在的固态、液态和气态三种形式都可以相互转化。 实验证明，当温度、压力达到一定数值时，气体的密度可增大到与液态一样，此时气相与液相的界面消失，液体的表面张力亦会随之消失，物理学中，将上述情况称为临界状态，将此时的温度和压力，分别称为临界温度和临界压力。 临界点干燥，就是利用物质
14、在临界状态下液体表面张力被消除的特性，克服样品干燥过程中的变性，保持样品原状，达到干燥的目的。,临界点干燥(CPD)效果,临界液的选择,概念：一般将临界干燥中起临界干燥作用的液体称为临界液 （又称媒介液）。 原则:临界温度及压力较低、价格便宜且保存方便。 典范：液态CO2的临界温度为31.4，临界压力为72kg/cm2,与其它媒介液相比更符合选择条件。因此，在临界点干燥时，液态CO2已被普遍使用。,临界点干燥的操作程序,样品预处理 放置样品 注入液体CO2 CO2置换 临界处理 放气取样,生物样品的导电处理,生物样品尤其是经过干燥处理的样品，其表面电阻率很高，导电性能很差，当接受电子束照射时，
15、易造成充电和放点效应，以至图像模糊不清。 此外生物样品元素成分原子序数低，二次电子发射率低，也难得到反差适当的图像，为增加导电性能，提高二次电子发射率，必须对样品进行导电处理。 金属喷镀法（喷金/铂金/铂合金）,扫描隧道显微镜 scanning tunneling microscope，STM,原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 分辨率：横向为0.10.2nm，纵向可达0.001n
16、m。 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。,扫描隧道电镜成像原理,扫描隧道显微镜观察的DNA双螺旋结构。,第一节 细胞形态结构的观察方法,第二节 细胞组分的分析方法,超速离心装置,离心机一般由离心机主机，转头，离心管三部分组成。,一、细胞器与生物大分子超速离心技术,离心分离的主要方法有两类： 利用颗粒大小的不同 差速离心法 速度区带离心法 利用颗粒密度的不同 等密度离心法,颗粒密度大于介质密度时， 离心颗粒向管底移动，速度 取决于颗粒的大小，大颗粒 沉降快，小颗粒沉降慢。,差速离心法,利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和颗粒分开。 适于大小差别较大的颗粒的分离。,差速离心分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 优点：操作简易，离心时间短；介质浓度低，对细胞结构成分损伤小；离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开。 缺点：须多次离
