精液分析与规范化2剖析.

《精液分析与规范化2剖析.》由会员分享，可在线阅读，更多相关《精液分析与规范化2剖析.（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1,精液分析与规范化,九江学院临床学院/附属医院 检验科 刘 怀,规范化背景:,精液分析存在问题： 检测方法不一； 结果带有主观性、不客观、不真实； 精确度低、重复性差； 对男性生育力的评估、临床诊断应用价值很有限；,2,标准化,强烈要求,实验室精液分析的系统化很大程度上归功于John MacLeod教授(苏格兰人)； 从19世纪40年代早期开始的40年间，发表了一系列有关精液分析的里程碑式的文章，并且和统计学家（Ruth Gold）合作，首次对精液分析进行了大规模规范化的研究。,3,规范化背景：,4,规范化背景:,20世纪60年代开始，由于研制男性避孕药的推动，促进了精液分析的进一步发展；

2、1965，WHO专门成立了人类生殖部门。卓越的男科学家Geoff Waites时任WHO官员开创性地提出精液分析技术规范与标准化的理念。 WHO于1980年首次出版了人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册。 迅即被全球广泛接受并作为男性不育与男性避孕研究和临床实践的“金标准”。,5,WHO2,1987,WHO4,1999,背景:,6,规范化背景:,第二版 第三版 第四版,7,规范化背景:,Trevor Graham Cooper 德国Mnster大学生殖医学与男科学中心男科实验室主任、亚洲男科学杂志顾问组成员、精液分析外部指控项目组织人。 研究领域：精子发生、精液分析、男性不育等,共

3、识,对 立,WHO人类精液检查与处理实验手册 （第五版）,8,2010,WHO5修改的目的,提高精液分析各参数的准确性； 简化方法，提高可操作性； 提供质控结果不良时的应对提示及细节； 利于实验室间的标准化； 提高精液分析各参数的临床应用价值（结果判断评述）； 提高疗效评估的准确性。,9,10,第5版手册提纲,11,精液常规分析标准化,1、目测精液外观 2、评估精液的液化状态及粘稠度 3、测量精液体积 4、检测精液PH值 5、检测精子浓度 6、检测精子活力 7、评估精子形态,标本的采集,时间间隔 禁欲48h,7d 禁欲的天数应尽可能恒定 精液采集完整 不完整的精液不宜进行分析，应注明。 初检者

4、 应做2次分析，2次间隔7d,3w 2次结果有明显差异，应进行第3次。,12,精液的液化,体外立即凝固，进入液化过程，在15min内完成。 60min不液化应视为异常。 观察记录液化时间：5、15、30、60 处理 机械混匀 加酶（影响精子活力，精子形态和精浆的生化）,13,精液粘稠度,评估粘稠度方法： 宽孔的5mm吸管法： 玻璃棒法： 2cm的拉丝,14,精液PH,pH试纸法：均匀涂抹一滴，等浸渍区颜色均匀后（30s内）立即与标准条带颜色对比，读出pH值。 精密试纸pH5.0-9.0 要求在1h内测定。 测试前，混匀哟。,15,显微镜检查内容,内容 一、精子浓度 二、精子活力 三、精子存活率

5、 四、精子形态分析,16,相差显微镜,精液检测工具,精液检测工具,血细胞计数板，WHO第四版及以前推荐 www.QJSH.com Marker:以色列Makler发明，1978 ,17,精液检测工具,Macro精子计数板，南京源成公司 Micro-cell：由Ginabury和Armand发明，一次性，美国Conception Technologies公司生产。 CELL-VU:2004年，美国Millennium Sciences公司产品 ,18,取样：充分混匀，各10ul精液， 冲池：22mmx22mm盖玻片； 放置：1分钟。 注意：避免产生气泡；保温台上操作。,19,一、精子计数,20,

6、一次射精中的精子总数能够提供反映睾丸功能的更为精确的信息。 因此，新版手册强调必须精确地测定精液体积。,精液体积测定,收集容器,21,22,精液量: WHO5不推荐的方法,将取精杯中的精液转移,X,X,X,23,精液量: WHO5不推荐的方法,吸取或抽取至量筒会导致: 错误的低体积 -0.4 -0.9 ml (丢失14%) (Cooper et al. 2007),为什么?,24,精液体积测定,根据重量间接计算精液体积，假定精液比重为1 g/ml(实际为1.014 g/ml)来计算 。 （首选方法） 1、秤取容器的重量， 2、秤取装有精液的容器的重量， 3、计算重量之差（g = ml）,25,

7、WHO推荐使用的精液量测定方法有两种， 一是用锥形底的刻度量筒法， 二是称重法。 因称重法与精液密度有关，故推荐以刻度量筒法检测精液量为好，要精确到0.1ml。 不推荐用目测法来检测精液量。,精液体积测定,成功的第一步,26,精液是不均匀的!,检测前样本充分混匀,第一部分：精子浓度高 快速运动精子 形态正常,第二部分：精子浓度低 慢速运动精子 形态异常,成功的第二步,27,精液计数：每份标本均重复稀释、取样2次，各自计数至少200个精子，对比两次检测结果。,一、精子计数,28,注 意,制备两份分别稀释的样本； 不将同一份稀释样本加入到两个计数池中； 不要两次计数同一个计数池。,29,注 意,W

8、HO5版明文禁止的几种计数方法： 1、对同一计数池进行二次计数。 2、一次抽样填充一块计数板的两个计数池。 3、二次结果的差异值大于可接受值时，尝试第三次计数，并计算三个数值的平均值或最相近的两个值的平均值。,30,注 意,成功的第三步,WHO5要求：抽样误差10%不可取。,31,一、精子计数,32,稀释 个数 / HP 观测,WHO4 更多更高 1+49 1+19 1+9 1+4 200 40-200 15-40 15 中央格 (#5) 5, 10, 25小正方形,WHO5 更少更低 1+19 1+4 1+1 100 16-100 2-15 3个格 (#4, 5, 6) 1排(20 nl),

9、一、精子计数,成功的第四步,计算机辅助精液分析 (Computer-aided sperm analysis CASA),33,精子计数,校准： 1、图像校准 2、手工计数校准,注意事项,1、自身的波动性 精子浓度：一次/w，连续120w 期间未服药，也无发热 结果显示精子浓度可有显著性波动,35,精子计数,2、WHO5方法要求：要求首次检查应连续进行两次，间隔时间3d-7d，两次结果差异大时应再检一次。,36,注意事项,37,1、计数多少精子？,精子数目计数的准确性依赖于所计数的精子数量。 在Poisson分布中，计数（N）的标准差是它的平方根（N），95%可信区间大约是N 1.96 N（接

10、近N 2N）。 计数200个精子，那么标准差就是14，95%可信区间就是172-228。如果计数400个精子，标准差是20，95%可信区间是360-440。 第五版手册推荐每份标本的两个重复样本各自计数至少200个精子。,38,两次计数的总和,Difference between duplicate counts,两次计数的一致: Poisson 分布,例如, 计数400 精子, 可接受的差异是39 如果39,需进行两次更多的稀释,0,100,200,300,400,500,600,0,10,20,30,40,50,39,两次精子浓度检测比对,四步成功前提，你掌握了吗？,40,精子计数小结,当

11、精子浓度过低时，精子的计数常常存在很大的抽样误差，而且需要检测很多个显微视野，尤其是检测离心后的充满碎片杂质的片子往往不够清晰，因此“无精子症”的诊断容易受到影响。 新版本建议：根据检测目的和要求的不同，对“少精子症”和“可疑无精子症”的标本分别采用不同的处理方法。,2、精子数低的样本,如果初始湿片制备中精子数目太低(每400高倍视野4：大约1106/ml)，此时可不要求计算准确的精子数量。,42,2、精子数低的样本,精液分析,少的精子 = 大的计数误差；,不必精确测定时,43,粗略估计 如果4/400 HPF ， 则说明浓度为 “ 2106 /ml”,2、精子数低的样本,不必精确测定时,44

12、,2、精子数低的样本,福尔马林1:1稀释，相差显微镜检测,福尔马林1:1稀释， Hoechst 33342染色，荧光显微镜检测,需要精确评估时:减少稀释倍数、测定更大的体积,45,3、是否真的“无精子症”？,RCF,有精子的无精子症样本所占百分比%,14例“无精子症”样本离心沉淀中的精子随离心时间(10 - 15 min)、离心力 (600 3600g)的增加而增加。Lindsay et al., 1995 Lancet 345: 1642,离心3000g 15 min，不是所有的精子都能沉淀。,23/25 非无精子症样本离心后的上清中有精子存在。Corea Corea et al., 200

13、5 et al., 2005 Fertil Steril Fertil Steril 83: 920,46,3、存在精子吗？,取1 ml 精液，离心3000g15 min；弃上清，留下50l液体； 取2份10l 沉淀加于载片，分别加盖22mm22mm盖片(20m深)； 观察整个盖片 (2480个视野)；如果有精子，则为“隐匿精子症”。,3000g离心15分钟并不能将样本中的精子全部分离出来：在离心管中能否找到精子取决于离心时间、速度（Lindsay et al., 1995; Jaffe et al., 1998) 和检测的离心样本数量； 在两个载玻片中均未发现精子诊断为“无精子症”。 注意：

14、未见精子 没有精子存在； 0 的95%可信区间上限= 3.7。,47,3、存在精子吗？,48,年轻人 老年人 差异 精子浓度 (106/ml) 73 64 NS 精液量(ml) 3.2 1.8 P0.05 精子数量 (106/ejac.) 206 74 P0.05 Ng et al. 2004,4、精子浓度还是精子总数?,每次射精的精子总数: 那些从附睾进入尿道的 那些进入女性生殖道的 睾丸功能的诊断 受精的预兆 输精管通畅,49,二、精子活动力检测,精子前向运动的情况与受孕具有密切的关联； 新版手册中一个重要的修订是精子活动力的分类方法。 精子活动力的分类 前向运动（Progressive

15、motility，PR） 非前向运动（Non-progressive motility，NP） 不运动（Immotility，IM ）,50,精子活动力检测,室温或37度评估，深度20微米，允许精子自由运动 深度D（mm） = 体积V（l, mm3）/ 面积(mm2),21x26 11ul,51,精子活动力检测,如果可能，应在至少5个不同视野里分析2200个精子； 使用目镜记数线限制记数范围，避开玻片边缘。,5mm,52,精子活动力检测,要准确地评估精子活动力，应将精液充分混匀后，重复取样2次分别检测，先仔细观察网格区计数前向运动精子，接下来是在相同的网格内的非前向运动精子，最后时不活动精子。 每个样本至少系统的观察5个视野，分析的精子应200个。两次分析结果之间的差异应在95%可信区间内，如果差异过大，则应重新混匀重新取样检查。,53,精子活动力检测,54,精子活动力分级,以往将前向运动精子分为快速和慢速，以37时速度25m/sec作为a级。但是对于技术员来说，很难如此精确无误地判断前向运动，新的分类方法更具有可操作性。,CASA分析,计算机辅助精液分析 (Computer-aided sperm analysis CASA),55,精子计数,校准： 3、精子运动录像校正,56,精子活动力分级,WHO4 WHO5 不动 d级 IM 非前向运动 c级