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1、综合实验1 植物利用光能的生理基础,一、实验教学目的 学习叶绿体色素的提取和定量测定的方法，并掌握分光光度计的使用方法。 了解叶绿体色素在植物光合作用中的光能吸收、传递和转换中的重要作用。 掌握叶绿体色素提取、分离方法，并了解它们的一些重要理化性质。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,二、实验意义 植物体内叶绿素与光合作用及氮素营养有密切关系，在科学施肥、育种及植物逆境生理等研究上常需对其进行测定。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本原理 (一）提取和分离 1.提取 高等植物叶绿体内的色素包括叶绿素(叶绿素a和叶绿素b)和类胡萝卜素(叶黄素和胡萝卜素)两大类，它们不溶于水，但溶
2、于有机溶剂，故常用丙酮或酒精等有机溶剂来提取。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本原理 (一）提取和分离 2.分离 纸层析法分离叶绿体色素是一种最简便的方法，其原理是当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在两相(流动相和固定相)具有不同的分配系数，其移动速率不同，经过一定时间后，可以将样品中不同色素分开。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本原理 （二）定量分析 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，即可计算出提取液中各种色素的含量。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本
3、原理 （三）理化性质 1.皂化反应 叶绿素是一种双羧酸(叶绿酸)与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯。在碱的作用下，发生皂化作用，生成醇(甲醇与叶绿醇)和叶绿素的盐(皂化叶绿素)。生成的盐能溶于水，故可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,叶绿素是双羧酸酯,其中一个羧基被甲醇所酯化,另一个被叶醇所酯化 。,叶绿素及其结构特点,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本原理 （三）理化性质 2.取代反应 在弱酸作用下，叶绿素分子中的镁为H+所取代，生成褐色的去镁叶绿素，后者遇乙酸铜则形成蓝绿色的铜代叶绿素。铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。,叶绿素分子含有一个卟啉环的“
4、头部”和一个叶绿醇(植醇)“尾巴”。卟啉环由四个吡咯环以四个甲烯基(-CH=)连接而成。,吡咯环的中央结合着一个镁离子。镁离子带正电荷,而与其相连的氮原子则带负电荷,因而具有极性,是亲水的。,卟啉环上的共轭双键和中央镁离子易被光激发而引起电子得失,使叶绿素具有特殊的光化学性质。,叶绿素及其结构特点,综合实验1 植物利用光能的生理基础,三、实验基本原理 （三）理化性质 3.荧光现象 叶绿素吸收光量子转变成激发态的叶绿素分子，很不稳定，当其回到基态时可发出荧光。,色素分子的激发与退激,激发,处于基态的色素分子，吸收光量子后，其中的电子由基态跃迁到激发态。,电子跃迁的能级状态由所吸收的能量决定：,蓝
5、光第二单线态,红光第一单线态,三线态电子自旋方向相同。,电子自旋方向相反,综合实验1 植物利用光能的生理基础,四、仪器试剂 玻璃仪器： (1)大试管5根、中试管2根 (2)烧杯和漓管 (3)25ml容量瓶4个 (4)量筒2个 (5) 指型管2根 (6) 毛细管2根 (7)康维皿1个 (8) 移液管5根 (9) 吸液球2个 试剂： (1)96% 乙醇 (2) 15% KOH甲醇溶液 (3) 蒸馏水 (4) 30%醋酸 (5) 苯 (6) 醋酸铜粉末,综合实验1 植物利用光能的生理基础,五、实验材料 1、水稻、小麦、玉米、大豆、棉花、蓖麻、烟草、向日葵等农作物叶片； 2、黄瓜、茄子、辣椒、豆角、大
6、白菜、萝卜等蔬菜绿叶、心叶、菜心、菜帮等； 3、八仙花、红叶石楠、大叶黄杨、海桐、木芙蓉、紫荆、珊瑚树等园林植物叶片； 4、枫香、木荷、梧桐、泡桐等林木叶片。,综合实验1 植物利用光能的生理基础,六、实验设计 测定叶绿体色素(叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素)含量，比较不同植物的光合特性： 1、C3、C4和CAM植物； 2、草本和木本植物； 3、不同颜色植物； 4、同一种植物在不同环境； 5、同一种植物不同处理； 6、同一种植物不同生长时期等。,称取剪至细丝状植物材料，每份0.10.2g,放入试管，加96%乙醇1015ml,6070水浴中提取，直至叶片成黄白色,提取液转移至25ml容量瓶中，将试
7、管中的叶绿体色素全部洗入容量瓶中，直至洗液中无绿色为止,用96乙醇定容至25ml，摇匀,分别在波长665 nm、649 nm、470 nm及652nm比色,七、实验步骤,（一）叶绿体色素的提取及定量测定,称重、水浴操作步骤,取一张长滤纸条(1 cm2 cm),用毛细吸管吸取浓的叶绿体色素提取液涂抹滤纸条一侧长边,重复2030次，风干后卷成纸捻,插入圆形滤纸中央小孔中，使之刚刚与圆形滤纸齐平,把插有纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上，使纸捻下端浸入推动剂中,迅速将一培养皿盖在康维皿上,（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察,1.叶绿体色素的分离,取3mL叶绿体色素提取液放入试管内,加入1ml 20 KO
8、H甲醇溶液，摇匀,先后加入3ml苯、1ml蒸馏水，摇匀,静置,分层,（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察,2.叶绿体色素的理化性质,（）皂化反应,皂化反应现象记录,2.叶绿体色素的理化性质 （）叶绿素的荧光现象 将浓的叶绿体色素提取液放入试管内，在直射光下观察色素溶液在透射光下及反射光下的颜色有何不同？ （）光对叶绿素的破坏作用 将前面实验纸层析所得的色谱图纸，对半剪开，一半夹入书中，另一半放在强光下，0.51 h后，观察四种色素的颜色有何变化？,（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察,取3mL叶绿体色素提取液放入试管内,加入30%醋酸摇匀至变色,倾出一半于另一试管，加少许醋酸铜粉末,水浴加热1
9、2min,再次变色,（二）叶绿体色素的分离及理化性质观察,2.叶绿体色素的理化性质,（4）取代反应,取代反应现象记录,（一）叶绿体色素的提取及定量测定 按下式计算样品中各叶绿体色素的浓度(mgL-1) ： Ca=13.95A6656.88 A649 Cb=24.96A6497.32 A665 Cx.c=(1000A4702.05Ca114.8Cb)/245 如果仅在652 nm波长下比色，则用 CT(mgL-1)=( A6521000)/34.5计算叶绿素总浓度,八、结果与分析,（一）叶绿体色素的提取及定量测定 按下式计算样品中各色素的含量： 各种叶绿体色素的含量(mgg-1) = (CV)/
10、W 其中: C为上述各种叶绿体色素的浓度(mgL-1) ； V为提取液总量(ml，若比色前进行了稀释，则应乘以 稀释倍数)； W为样品鲜重(g) 。,八、结果与分析,综合实验2 植物对逆境的生理响应,实验设计 要求学生自带玉米、烟草、羊蹄等植物材料利用实验室条件人为设置逆境与正常条件形成对照（如高温与常温，低温与常温，干旱与保湿等），分析逆境对植物生长的影响： （一）植物体内游离脯氨酸含量的测定 （二）蒽酮法测定植物组织中可溶性糖的含量 （三）电导率仪测定离体植物叶片的抗逆性,实验结束要求 各组用品洗刷干净，玻璃仪器及药品摆放整齐、齐全之后报告老师或班长（同时实验报告上交学习委员），经检查同意可离去。 值日生请负责： 维护分光光度计、比色皿 擦洗台面 扫地、拖地,
