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1、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜 吴旭 2007.10.16 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统 激光共聚焦显微镜 结构结构 激光光源 倒置显微镜 扫描模块（包括共 聚焦光路通道和针 孔、扫描镜、检测 器） 数字信号处理器 计算机 历史历史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得 了美国的专利。 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断 面。 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非 线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。 1984年，Bior
2、ad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号 为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系 统。 1987年White和Amos在英国自然杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到 来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。 随后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出不同型号 的共聚焦显微镜，产品的性能不断改进和更新，应用的范围也越来越广 泛。 正置？倒置？正置？倒置？ 正置显微镜正置显微镜 标准盖玻片厚度0.17mm， 载玻片厚度1.1mm 载物台与物镜间的工作距 离有限 清晰
3、度高 物镜最大放大倍数150X 主要用于切片的观察 倒置显微镜倒置显微镜 物镜、聚光镜、光源的位置 颠倒 长工作距离物镜和聚光镜 透射光源和载物台之间空间 更宽敞 清晰度略低于正置 物镜最大放大率60X； 多用于无色透明的活体观 察 ，如组织培养、细胞离体 培养、浮游生物、环境保 护、食品检验 荧光原理荧光原理 荧光：短波长的光线照射某物质时，这 种物质在极短时间内，能发射出波长较 激发光长的可见光，这种光就称为“荧 光”。 如：FITC，激发光488nm，发射光 515nm； 异硫氰酸荧光素，激发光490nm，发 射光525nm。 荧光显微镜的光源和光路荧光显微镜的光源和光路 明场：透射 荧
4、光：落射 落射的优点： 物镜的聚光镜作用 使视场均匀，发射 光强度高。 激发光损失小，荧 光效应高。 分光镜组件结构分光镜组件结构 荧光显微图像实例荧光显微图像实例 原理原理 由于pinhole的存在，使得部 分杂散光（虚线部分）没有 被PMT探测器探测到，从而 提高了成像效果。 通过对样品在x-y方向上的逐 点扫描，可以形成二维图 像。如果调解焦平面在z方向 的位置，连续扫描多个不同z 位置的二维图像，则可以形 成一个3D图像，3D的重建需 要软件的支持。 原理原理 由于pinhole的存在，使得部 分杂散光（虚线部分）没有 被PMT探测器探测到，从而 提高了成像效果。 通过对样品在x-y方
5、向上的逐 点扫描，可以形成二维图 像。如果调解焦平面在z方向 的位置，连续扫描多个不同z 位置的二维图像，则可以形 成一个3D图像，3D的重建需 要软件的支持。 X Y Sequentially illuminated sample Sequentially generated image X Z Y Conventional fluorescence microscope Confocal microscope LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 图像相关概念图像相关概念 RGB三基色 图像数据位 亮度 对比度 饱和 怎样得到样品图像怎样得到样品图像 样品的标记物有合适的激发波长和发射
6、波长 荧光下观察选择合适的图象 设置激光扫描的通道参数 设置图象的属性 调节每一个通道的亮度、对比度、清晰 度、背景亮度 启动 共聚焦和共聚焦和CCDCCD照片的比较照片的比较 更大的动态范围 高灵敏度 图像背景的消除 灵活的拍照区域选择 ZOOM功能 伪彩色 环境要求高 多通道图象合成多通道图象合成 时间序列时间序列 Ca离子成像 FRAP：Fluorescence Redistribution After Photo bleaching FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度 脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子 的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的 速率向
7、受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度 激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。 LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和 恢复速率，反映细胞结构和活动机制。广泛用于研究 细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间 通讯等领域。 荧光漂白恢复（荧光漂白恢复（FRAPFRAP） 人卵细胞的局部光漂白 FRAP 研究ER-GFP的核转位 荧光共振能量转移（荧光共振能量转移（FRETFRET） FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的 传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量 的提供者叫
8、能量供体，能量的接受者叫能量受体。 能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一 个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近 有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两 个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射 方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转 移 DonorAcceptor 10 r100 () T FRET k 6 1 o T D R k r = FRET产生条件： 两个荧光分子：供 体-FL1，受体-FL2 供体与受体的距离 在2-7nm 供体的发射波长与 受体的激发波长一 致 应用实例应用实例 一一、组织光学切片 对活的或固定的细胞及组织进行无 损伤的系列光学切片
9、。这一功能又被简 称为“细胞CT”。 二、三维图像重建 由共聚焦显微镜的组织光学切片功 能采集获得的二维图像数据，经计算机 图像处理三维重建软件重组，可得到标 本的三维立体结构，揭示亚细胞结构的 空间关系，从而能十分灵活直观地进行 形态学研究。 三、细胞物理和生物化学测定 激光扫描共聚焦显微镜可进行低光探测、 活细胞定量分析和重复性极佳的荧光定量分 析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒 体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、 DNA、RNA、酶和受体分子等细胞结构的含 量、组分及分布进行定性、定量及定位测定。 另外，激光扫描共聚焦显微镜可以对细胞的面 积、细胞周长等参数进行自动测定。 四、荧
10、光的定性、定量分析 激光扫描共聚焦显微镜可对单标记或多标 记细胞及组织标本进行定量分析，并显示荧光 沿Z轴的强度变化；另外，借助于光学切片功 能可在毫不损失分辨力的条件下测量标本深度 的荧光分布。可以准确监测抗原表达、荧光原 位杂交及细胞结合和杀伤的形态学特性并进行 定量分析。 五、CA2+、pH及其它细胞内离子的动态测量 利用Fluo-3、Indo-1、Fura-Rad等多种荧 光探针，激光扫描共聚焦显微镜可对单个细胞 内离子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等）的动 态变化做实时定量分析；可以定量探测胞内 Ca2+对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及 各种激素等刺激的反应；使用双荧光
11、探针Fluo- 3和SNAF可同时测定Ca2+和pH值。也就是说 利用激光扫描共聚焦显微镜能进行细胞生理信 号的动态监测。 共聚焦显微镜的局限共聚焦显微镜的局限 标记染料的光漂白： 为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度；而高强度的激光会使 染料在连续扫描过程中迅速褪色。 光毒作用： 在激光照射下，许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒 素。 限制扫描时间、激发光强度，以保持样品的活性限制扫描时间、激发光强度，以保持样品的活性 双光子激发原理双光子激发原理 1931年，Maria Goppert-Mayer预言一个分子或院子可以在同一个量子 过程中，同时吸收两个光子而成为激发态。 196
12、1年，Kaiser等在CaF2:Eu2+晶体中首次观察到了这种双光子激发的过 程。 NADH酶在350nm的光激发下产生450nm的荧光，而在双光子激发情形 下，需同时吸收两个700nm的光子才能产生450nm的荧光。 双光子激发原理双光子激发原理 双光子吸收几率比单光子小的多，光强的平方成正 比。光强表示单位面积上的光功率，因此，具有高峰 值功率和高聚焦能力的超短脉冲激光器是理想光源。 Peak power (kW) Repetition frequency (Mhz) Pulse length (fs) time 优点优点 避免使用了紫外光，以及复杂的紫外波 段物镜和紫外光学元件。 具有较深的传播距离，可对浑浊样品表 面以下较深（200m）处成像。 飞秒量级的锁模钛宝石激光器可以比较 容易产生足够强的激光。 焦平面以外的杂散光更易难被监测器接 受 2 photon 1 photon Thank You!
