【2017年整理】质粒DNA提取方法与原理

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1、质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染 色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒 DNA 分子。目前已有许多方法可用于质 粒 DNA 的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒 DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为：当菌体在 NaOH 和 S

2、DS 溶液中裂解时，蛋白质与 DNA发生变性，当加入中和液后，质粒 DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体 DNA 不变性 而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离 子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀 等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒 DNA 已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实

3、验室 中常用。 一、试剂准备1. 溶液 : 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加 ddH2O 至 500ml。在 10 lbf/in2 高压灭菌 15min ，贮存于 4。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液。50 mM 葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质 粒的抽提本身而言，几乎没有

4、任何影响。所以说溶液 I 中葡萄糖是可缺的。EDTA 呢？大家知道 EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase 的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完 成质粒抽提，就不用怕 DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的 TE 缓冲液中有 EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液 I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你， 只要用等体积的水，或 LB 培养基来悬浮菌体就可以

5、了。NaOH 也使 DNA 变性，但只是个副产物，在溶液 3 加入后其中的醋酸和 NaOH 中和，质粒 DNA 恢复活性2. 溶液：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置 。这是用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2的 SDS 等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH 稀释制备 0.4N 的 NaOH，无非是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2 而减弱了碱 性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳 的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细

6、胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS 当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS 也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对 NaOH 的作用误以为是为了让基因组 DNA 变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关 DNA 变性复 性的描述所导致。有人不禁要问，既然是 NaOH 溶解的细胞，那为什么要加 SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第

7、一，时间不能过长，千 万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组 DNA 也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。3. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加 ddH2O 至 500ml。4保存备用。溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当 SDS 碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往 1%的 SDS 溶液中加如 2M 的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与 SDS 的加入有关

8、系。如果在溶液 II 中不加 SDS 会怎样呢，也会有少量 的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS 不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在 1的 SDS 溶液中慢慢加 入 5 N 的NaCl，你会发现 SDS 在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了 SDS 的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl 而是KCl，你会发现沉淀的量 要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而 PDS 是水不溶的，因此发生了沉淀。如此

9、看来，溶液 III 加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度 的盐，使得沉淀更完全。大家知道 SDS 专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质 沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被SDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组DNA 一旦发生断裂，只要

10、是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA 混入，琼脂糖电 泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也 好，DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一点。 4. TE： 10mM Tris-HCl(pH 8.

11、0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O 至 100ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌 20min，4保存备用。5.苯酚/氯仿 /异戊醇（25：24：1）不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳 定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。这里用25/24/1 的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚 （Phenol）对蛋白质的变性作用远

12、大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4M 的 异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水 有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一 次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于 异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界

13、面更加清晰，也方便了水相的回收。6.乙醇（无水乙醇、70%乙醇）回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。这时候如果放到20，时间一长反而会 导致大量盐的沉淀，这点不同于普通的 DNA 酒精沉淀回收，所以不要过分小心了。高浓度的盐会水合大量的水分子，因此 DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉 淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用 tip 将沉淀打碎，就能得到好的样品。得到的质粒样品一般用含 RNase（50 ug/ml）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解的 RNA

14、会干扰电泳结果的.7. 5TBE：Tris 碱 54g，硼酸 27.5g，EDTA-Na22H2O 4.65g，加 ddH2O 至 1000ml。15 lbf/in2 高压湿热灭菌20min，4保存备用。8溴化乙锭（EB）：10mg/ml9.RNase A（RNA 酶 A）：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/ml，TE 配制，沸水加热 15min，分装后贮存于-20。10. 6loading buffer（上样缓冲液）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青 FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。11. 1% 琼脂糖凝胶：称取 1g 琼脂糖于三角烧瓶中，加 10

15、0ml 0.5TBE，微波炉加热至完全溶化，冷却至 60左右，加EB 母液（10mg/ml）至终浓度 0.5g/ml（注意：EB 为强诱变剂，操作时带手 套），轻轻摇匀。缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中，勿使有气泡，静置冷却 30min 以上，轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳缓冲液 0.5TBE），即可上 样。 二、操作步骤 1. 挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37、250g 振荡培养过夜（约12-14hr）。2.取 1.5ml 培养物入微量离心管中，室温离心 8000g1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。3.将细菌沉淀重

16、悬于 100l 预冷的溶液（50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）中，剧烈振荡，使菌体分散混匀，（且不至于沉淀）。4. 加 200l 新鲜配制的溶液 ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心管放置于冰上 2-3min，使细胞膜裂解（溶液为裂解液，故离心管中菌液逐渐变 清）。5.加入 150l 预冷的溶液（醋酸甲 AcK），将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置 3-5min。溶液为中和溶液，此时质粒 DNA 复 性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时 K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。6.加入 450l 的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4 离心 12000g 10min。没有用 PDS 沉淀干净的蛋白质置于下层7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，4离 心12000g15min。1.为什么用无水乙醇沉淀 DNA？ 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实