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1、第一部分 微生物的利用,实验1 大肠杆菌的培养和分离,教学要求,大肠杆菌,1、革兰氏阴性,2、异养兼性厌氧肠道杆菌,4、基因工程中被广泛应用,大肠杆菌质粒载体 大肠杆菌受体细胞,3、繁殖方式：二分裂,培养：LB液体培养基进行扩大培养,分离：LB固体平面培养基划线分离,一、实验材料,1、大肠杆菌菌种斜面：提供实验用的大肠杆菌。,2、LB液体培养基(溶菌肉汤培养基) （1）蛋白胨： （2）酵母提取液： （3） Nacl： （4）水： （琼脂：凝固）,生长因子：微生物生长不可缺少的微量有机物,提供碳源、氮源、生长因子等。,提供生长因子（维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等）,维持渗透压,良好的溶剂，维持生物
2、大分子结构的稳定。,二、实验步骤,1、液体培养基灭菌,灭菌对象：,灭菌方法：高压蒸汽灭菌,（1Kg/cm2压力、121、1530分钟）,（500g/cm2压力、90以上、30分钟）,若有机物加热会分解,灼烧灭菌,干热灭菌：160-170 下加热1-2h。,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 而培
3、养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,2、分装倒平板,操作环境：超净工作台。,操作前进行消毒：用酒精棉球擦拭桌面和手。,操作:,使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。,消毒,a.煮沸消毒法 b.巴氏消毒法（低温消毒法）:如牛奶的消毒 c.化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 d.紫外线消毒,方法,倒平板技术,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需
4、要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,5.如何判断培养基是无菌的？,将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,灭菌和消毒的比较,芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体。,芽孢的壁很厚，对干旱、
5、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。,当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。,3、接种扩大培养,接种环灭菌：灼烧灭菌,4、划线分离,倒置,通过接种环在培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。,4、划线分离,在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法,平板划线时不能划破培养基的原因,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。,问题讨论,1.为什么在操作的第一
6、步灼烧接种环？,1.操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,2.以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,3.划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,4.第一次划线后，每次划线之前都要灼烧接种环吗？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环
7、上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,4、划线分离,接种环只在菌液中蘸菌液一次,划线后培养皿倒置,培养基培养后：在划线的末端出现不连续 的单个菌落，表明菌已分离。,涂布分离法,第一步：系列稀释操作,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。,第二步：涂布平板操作,划线分离：方法简单 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。,5、单菌落接种培养,单菌落,接种环划线接种,菌种的保存,1、临时保藏：接种到
8、固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。,扩展：可以用培养基对微生物进行分离,(1)培养基中的营养成分的改变可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。又如加高浓度的食盐,抑
9、制多种细菌生长,分离到金黄色葡萄球菌。,(2)当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离出能消除石油污染的微生物的目的。,(3)改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。,分析下面培养基的配方：葡萄糖、尿素、琼脂、 KH2PO4、Na2HPO4、MgSO47H2O。请回答： (1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是_和_。 (2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？,葡萄
10、糖,尿素,有选择作用。因为此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长,(3)培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌、消毒方法依次是( ) 化学消毒 灼烧灭菌 干热灭菌 紫外线灭菌高压蒸汽灭菌 巴氏消毒法 A B C D,A,实验1：大肠杆菌的培养和分离,设备及用品： 灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm120mm）5支 实验材料： (1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0
11、.25g、NaCl 0.5g、加水50ml。 (2)大肠杆菌菌种斜面 (3)空白斜面,实验步骤,(1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液体培养基分别装入两个250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。 (2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。 (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37摇床振荡培养12h。 (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37恒温培养箱中进行培养。 (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37下培养24h, 4冰箱保存。,实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。,超净工作台,打开紫外灯和过滤风 （用紫外灯灭菌，打开紫外灯后人必须离开。）,进行操作时，关闭紫外灯。,超净工作台,
