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1、第二章 DNA的生物合成,中心法则 (The Central Dogma),第一节 DNA复制的基本特征,一、半保留复制 (semiconservative replication) 当DNA进行复制时，双螺旋结构解开成两条单链，各自作为模板合成与之互补的新链。在子代DNA双链中，一条是来自于亲代，另一条完全重新合成 。 这种复制方式称为半保留复制,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想,二、从复制起点双向复制,1、复制起点（ori/O）有几十甚至几百个碱基的跨度，富含AT,2、复制子（replicon）从一个复制起点引发复制的全部DNA序列,3、复制叉（replication fork）
2、复制时在解链点形成分叉结构,前导链 ( leading strand ) 顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，所得到一条连续片段的子链。,三、半不连续复制 （semidiscontinuou replication）,3 ,5 ,3 ,5 ,解链方向,冈崎片段（ Okazaki fragment ） 分段合成的后随链片段,3,5,第二节 原核生物DNA的复制,一、参与DNA复制的酶和蛋白质,（一） DNA 聚合酶（DNA polymerase） 其特点是:需要模板(template) 需要引物（primer） 寡核苷酸3 - OH 以53方向催化合成DNA,1、大肠杆菌DNA聚合酶种类
3、（五种 ）,现已知大肠杆菌存在DNA聚合酶I、II、III、IV和V。 DNA聚合酶I非主要聚合酶，可确保DNA合成的准确性，并可切除紫外线照射产生的嘧啶二聚体。 DNA聚合酶II 主要生理功能为修复DNA。 DNA聚合酶III 为主导聚合酶。 DNA聚合酶IV和V主要在SOS修复中起作用。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段 / Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,在复制延长过程中真正催化新链核苷酸聚合的酶,DNA-pol ,DNA-pol ,1、5 3 的DNA聚合酶活性：聚合速度，延伸能力 2、3 5 外切酶活性 ：能辨认错配的碱基对
4、，并将其水解（校对） 3、5 3 外切酶活性：切口平移（nick translation）,?,2、大肠杆菌DNA聚合酶功能,切口平移（nick translation）,定义：如果双链DN分子上存在切口，DNA聚合酶I可以在切口处催化两个反应：一个是水解反应，从5端切除核苷酸；另一个是聚合反应，在3端延伸合成DNA，结果反应过程像是切口在移动,意义:在DNA复制过程切除后随链冈崎片段5端的RNA引物 在DNA修复过程中发挥作用,（二）解链、解旋酶类,1、解旋酶（helicase） 利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,2、拓扑异构酶（topoisomerase） 双链D
5、NA分子两股链的绕数称为拓扑连环数 具有相同的一级结构、不同的拓扑连环数的DNA分子互为拓扑异构体 拓扑异构酶通过改变DNA的拓扑连环数来改变其拓扑结构。,解链过程中，DNA分子会过度拧紧、打结、缠绕、连环等现象，均需DNA拓扑异构酶，改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行 拓扑异构酶作用特点： 既能水解 、又能连接磷酸二酯键,分类：,型拓扑异构酶,型拓扑异构酶,型拓扑异构酶 催化DNA的一股链发生断裂和再连接 消除负超螺旋 (增加连环数)，反应不消耗高能化合物 主要参与RNA的转录合成,型拓扑异构酶 催化DNA的两股链同时发生断裂和再连接 既可消除负超螺旋 (增加连环数)，也可引
6、入负超螺旋 (减少连环数，耗能) 主要参与DNA的复制合成,3、单链DNA结合蛋白（SSB）,维持单链稳定 抑制RNA聚合酶,（三）引物酶（primase，引发酶）,引物酶 依赖DNA的RNA聚合酶 在模板的复制起始部位催化NTP的聚合, 形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物（primer），提供3-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。 引发体（primosome）：DnaG+ DnaB 引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物,（四）DNA连接酶（DNA ligase）,连接DNA链3- OH末端和相邻DNA链5- P末端，使二者生成磷酸酯键 ，从而把两段相邻的DN
7、A链连接成完整的链（只能连接dsDNA上nick） 参与DNA复制、重组、修复,二、复制过程,在大肠杆菌DNA的复制过程中，各种与复制有关的酶和蛋白因子结合在复制叉上，构成复制体(replisome) 复制过程可以分为起始、延长和终止三个阶段 不同阶段的复制体具有不同的组成和结构,（一）复制起点,1、复制起点 （E.coli-oriC，245bp） 两种保守序列 ：三段同向串联重复排列的13bp序列，富含AT；四段反向重复排列的9bp序列,2、有关的酶和蛋白质 起始阶段至少需要九种酶和蛋白质 作用是解开复制起点的DNA双链，装配前引发复合体 (prepriming complex),大肠杆菌复
8、制原点起始复制所需蛋白质,SSB,解链酶,引物,引物酶,拓扑异构酶,3、起始过程 约20个DnaAATP复合物结合于oriC的9bp序列上 HU类组蛋白与DNA结合，便13bp序列解链 (消耗ATP) 两个解旋酶DnaB六聚体在DnaC蛋白的协助下与开放区域结合解链 SSB与DNA单链结合，拓扑异构酶II负责松解DNA双链,1、引物合成,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,3,5,3,5,（一）复制延长,DNA聚合酶催化游离的脱氧核苷酸结合到新链3末端，使其不断延长。,2、复制延长的过程,DNA双链是反向互补的，而前导链和后随链是被一个DNA聚合酶III复合体催化同
9、时合成的。为此，后随链的模板必须绕成一个回环。,3、复制过程的保真机制,53聚合酶活性中心对底物的选择 35外切酶活性中心的校对,E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终止蛋白 tus 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC terG 共7个终止位点。,（三）复制终止,三、原核生物DNA合成抑制剂,一些抗生素通过抑制DNA合成杀死原核病原体。 (l)喹诺酮类 (quinolone):解旋酶和拓扑异构酶IV (2)硝基呋喃类(nitrofuran):攻击DNA、核糖体蛋白、呼吸链、丙酮酸脱氢酶系 (3)硝基咪唑类（nitroimidazole):还原产
10、物与厌氧菌DNA结合，抑制其复制与转录,第三节 真核生物DNA的复制,一、染色体DNA,（一） 染色体DNA 复制特点,1复制速度慢 复制叉的推进速度约为5Ont/s，仅为大肠杆菌1/20 2发生染色质解离与重塑 复制叉经过核小体时需要解开核小体结构; 经过之后，要在两条子代DNA双链上重塑核小体结构 3多起点复制 真核生物的染色体DNA有多个复制起点，同时启动复制，形成多复制子结构，每个复制子控制的复制区域比较小 4冈崎片段小 真核生物150-2OOnt，而大肠杆菌1000-2000nt。 5终止阶段涉及端粒合成 真核生物的染色体DNA为线性结构，其末端端粒DNA通过特殊机制合成 6受DNA
11、复制检验点控制 真核生物的染色体DNA在一个细胞周期中只复制一次,（二）DNA聚合酶,、 、 、 、 负责核DNA的复制 负责线粒体DNA的复制,1，染色体DNA呈线状，复制在末端停止,2，连接不连续片段,（三）端粒与复制终止,短缺,短缺,端粒（ telomere ）,真核生物染色体线性DNA分子末端的结构,1、结构特点：,1）由末端单链DNA序列和蛋白质构成,2）末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列,2、功能,1）维持染色体的稳定性,2）维持DNA复制的完整性,3）细胞分裂计数器,4）长度反映端粒酶活性,端粒酶（ telomerase）,二、线粒体DNA (mtDNA),H链;
12、L链; 复制起点错位分布 DNA聚合酶催化复制 不对称复制 这种复制的前期是以新生L链替换亲代L链的过程，并且亲代L链的游离结构形如字母D，所以这种复制被形象地称为D环复制(D-loop replication）,第四节 病毒DNA的复制,由基因组特征和宿主DNA复制系统共同决定,一、病毒DNA：双链环状DNA，核内由宿主细胞的复制酶系统完成,滚环复制,rolling circle replication,二、噬菌体DNA,第五节 DNA损伤与修复,一、DNA损伤 稳定是相对的，变异是绝对的 变异即基因突变，其化学本质是DNA损伤，是指碱基序列发生了可以传递给子代细胞的变化，这种变化通常导致一
13、个基因产物功能的改变或缺失,（一）损伤类型,1、点突变：指DNA分子上一个碱基的变异 错配（ 转换，颠换） 一个核苷酸缺失、插入 2、插入和缺失,移码突变,插入、缺失一个或两个碱基都会造成对阅读框架的影响，即产生移码突变 移码突变会导致表达产物蛋白质一级结构的改变，导致蛋白质合成的过早终止或蛋白质功能的丧失,遗传信息的改变,同义突变 错义突变：导致蛋白质多肽链氨基酸序列变化。 无义突变：肽链合成提前终止。,3、重排 是指基因组中DNA发生较大片段的交换，但不涉及遗传物质的丢失与获得 重排发生在基因组中，可以在DNA分子内部，也可以在DNA分子之间 4、共价交联 胸腺嘧啶二聚体,（二）损伤因素,
14、1、复制错误 复制滑脱- “环出”现象 新生链环出会造成子二代DNA发生插入，而模板环出会造成缺失 2、自发性损伤 3、物理因素：紫外线 4、化学因素：烷化剂、碱基修饰剂（亚硝酸盐） 5、生物因素：病毒,（三）损伤意义,突变是生物进化的分子基础 致死突变 突变是许多疾病的分子基础,二、DNA修复,五种修复系统: 错配修复 直接修复 切除修复 重组修复 易错修复,DNA复制过程之外，精确修复,DNA复制过程之中，不完全修复,（一）错配修复,Dam甲基化酶使母链位于5GATC序列中腺苷酸甲基化 甲基化紧随在DNA复制之后进行 根据复制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子链上的错配碱基,根据母链
15、甲基化原则找出错配碱基的示意图,发现错配碱基,在水解ATP的作用下，MutS， MutL与碱基错配点的DNA双链结合,MutS-MutL在DNA双链上移动，发现甲基化DNA后由MutH切开非甲基化的子链,（一）错配修复,甲基化指导的错配修复示意图,错配碱基位于切口3下游端，,错配碱基位于切口5上游端，,1、光修复（ light repairing ）,光修复酶,UV,（二）直接修复,2、烷基化碱基修复 一些酶识别DNA中修饰碱基,（三）切除修复,是指将DNA分子的损伤片段切除，然后以互补链为模板，合成DNA填补缺口，使DNA恢复正常结构 原核生物和真核生物都有两套切除修复系统: 核苷酸切除修复
16、系统 碱基切除修复系统 都包括两个步骤: 由特异性核酸酶寻找损伤部位，切除损伤片段; 合成DNA填补缺口。,核苷酸切除修复,是细胞内最重要的修复机制 ，主要由切除核酸酶（Uvr）、DNA聚合酶和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,修复的对象是子代DNA。 损伤的DNA先进行复制，在子代DNA损伤互补的部位出现缺口，通过分子间重组，将另一个子代完好的片段移至缺口处，再填补重组产生的缺口。 模板上的伤疤始终留着。只能随着重组修复次数，伤疤占的比例。,（四）重组修复,DNA损伤严重将激活与DNA修复有关的基因，这一现象称为SOS应答 (SOS response) SOS应答产生两类效应:增加与其他修复系统有关基因的表达，从而提高修复能力; 启动易错修复系统 DNA聚合酶IV和V
