酶工程学-第十三、十四周固定化..

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1、酶工程学,Enzyme Engineering,第十十一周,学习内容,绪论(第一章),酶的生产,酶的改性,酶的应用,酶生物合成的基本理论(第二章) 酶的生物合成法(第三章) 酶的提取与分离纯化(第四章),酶改性的基本理论(第五章) 酶分子修饰(第六章) 酶固定化(第七章) 酶的非水相催化(第八章),酶应用的基本理论(第九章) 酶反应器的应用(第十章) 酶的应用领域(第十一章),第七章 酶固定化,Immobilized Enzyme,第一节 概述 第二节 固定化酶的性质及其影响因素 第三节 固定化酶的制备 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用

2、,内容提要,图6-1 生物催化剂作用方式示意,第一节 概 述,游离酶的缺点： 1.酶的稳定性较差，在温度、pH、和无机离子等外界因素的影响下，容易变性失活。 2.酶一般都是在水溶液中与底物反应，反应结束后酶难以回收。 3.反应结束后，酶成为产物的杂质。,固定化酶：,固定化酶是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著特点。直接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体或固定化死细胞。,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,固定化酶的优缺点 多次使用 可

3、以装塔连续反应 优点： 纯化简单 提高产物质量 应用范围广 缺点： 首次投入成本高 大分子底物较困难,第二 节 固定化酶的制备,一、 一般方法及特点 二、 酶的固定化方法,一、 选择方法依据：,（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择,二、 酶的固定化方法,（一） 吸附法 （二）结合法 （三）交联法 （四） 包埋法,（一） 吸附法,1. 物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。 选择载体的原则： （1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面 （3） 便于装柱进行连续反应。,常用载体：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石,优点：,

4、缺点：结合力不劳、容易脱落。,吸附法常用的载体及优、缺点,操作简单、条件温和、 载体廉价易得、可反复使用。,（二）结合法,离子键结合法 共价键结合法,定义：选择适宜载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。,1. 离子键结合法,概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。 常用载体:DEAE-纤维素， DEAE-葡聚糖凝胶 使用注意：pH、离子强度、温度,2. 共价键结合法,概念：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。 可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机

5、载体,共价键结合法制备固定化酶的“通式”,首先载体上引进活泼基团 然后活化该活泼基团 最后此活泼基团再与酶分子上某一基团形成共价键,载体活化的方法,A重氮法 B叠氮法 C烷基化反应法 D硅烷化法 E溴化氰法,A重氮法,反应式：,目前在我们国内用的较多的载体：,该方法需要载体具有芳香族氨基,氨基苯磺酰乙基（ABSE）纤维素 琼脂糖 葡聚糖凝胶 琼脂 ,反应式及原理,B 叠氮法,例：用羧甲基纤维素叠氮衍生物制备固定化胰蛋白酶 步骤如下：,酯化 肼解 叠氮化 偶联,C烷基化反应法,含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。,D硅烷化法,载体特点： 机械强度好，表面积大。

6、 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿命长等。,常用的载体：多孔玻璃，多孔陶瓷。,E 溴化氰法,本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类物质。如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数（大孔网状结构）。用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。,（三） 交联法,定义：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。,1. 交联法常用试剂,戊二醛 己二胺 顺丁烯二酸酐 双偶氮苯,4,4-双(二甲氨基)偶氮苯,2. 交联法的形式,交联法有2种形式：,酶直接交联法 酶辅助蛋

7、白交联法,酶直接交联法：,在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。,酶辅助蛋白交联法：,为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起酶失活，可使用第二个“载体“蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。,（四） 包埋法,定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。,琼脂 琼脂糖 海藻酸钠 角叉菜胶 明胶 聚丙烯酰胺,载体：,1网格型,定义：将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。,

8、2微囊型包埋法,定义：将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。,微囊化法制备固定化酶有两种方法,界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。 界面聚合法：是用化学手段制备微囊的方法。利用油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。,第三节 固定化酶的性质及其影响因素,一、 影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、 评价固定化酶的指标,一、 影响固定化酶性质的因素,1 酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化。 2 载体的

9、影响 （1） 分配效应 （2） 空间障碍效应 （3） 扩散限制效应 3. 固定化方法的影响,二、固定化后酶性质的变化,1 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化 空间位阻 2 固定化对酶稳定性的影响 （1） 操作稳定性提高 （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高。 （3）对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 （4 ）对分解酶的稳定性提高。 （5）对变性剂的耐受力升高,三、固定化后酶稳定性提高的原因,固定化后酶分子与载体多点连接。 酶活力的释放是缓慢的。 抑制自降解，提高了酶稳定性。,四、 pH的影响,（一）pH对酶活性的影响： （1） 改变酶的空间构象 （2）影响酶

10、的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离 （4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。,（二）pH对固定化酶的影响,1. 载体带负电荷，pH向碱性方向移动。 2. 载体带正电荷，pH向酸性方向移动。,微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称为宏观环境。,催化反应的产物为酸性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值高。 催化反应的产物为碱性时，固定化酶的pH值比游离酶的pH值低。,（三）产物性质对体系pH的影响,（四） 最适温度变化,作用于低分子底物的酶，特异性没有明显变化 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶，特异性往往会变化。,一般与游离酶差不多，但有

11、些会有较明显的变化。,（五）底物特异性变化,（六）米氏常数Km的变化，Km值随载体性质变化,（1） 载体与底物带相同电荷，KmKm固定化酶降低了酶的亲和力。 （2） 载体与底物电荷相反，静电作用，KmKm。,五、 评价固定化酶的指标：,1. 酶活定义（IU)：在特定条件下，每一分钟催化一个微摩尔底物转化为产物的酶量定义为1个酶活单位。 2. 酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的酶活力单位,（一）游离酶,1. 固定化酶的比活： 每（克）干固定化酶所具有的酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 操作半衰期： 连续测活条件下固定化酶活

12、力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2），是衡量稳定性的指标。,（二）固定化酶,5. 相对酶活力：具有相同酶蛋白（或RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力,3.,4.,酶活力回收率也称偶联效率，活力保留百分数。,六、固定化酶的活力测定方法介绍,1. 振荡测定法： 2. 酶柱测定法： 3. 连续测定法：,利用连续分光光度法等测定方法可以对固定化酶反应液进行连续测定，从而测定固定化酶的酶活力。,第四节 微生物、植物和动物细胞固定化,细胞特性比较,固定化细胞,定义：固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞.该细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，又称固定

13、化活细胞或固定化增殖细胞。,固定化细胞的特点,类型：微生物细胞、植物细胞、动物细胞 生理状态：死细胞（完整细胞、细胞碎片、细胞器） 活细胞（增殖细胞、静止细胞、完整细胞） 形状：颗粒状、块状、条状、薄膜状或不规则形状。 使用周期：理论上讲，固定化增殖细胞保持了细胞原有的全部活性， 只要载体不解体，不污染就可以长期使用。,细胞固定化方法,吸附法 包埋法,吸附法,定义：通过载体与细胞间的静电引力，即细胞表面与载体之间范德华作用力，离子键和氢键作用力，才使细胞固定在载体上的。,pH35,+,+,+,+,+,+,+,+,影响吸附法的主要因素,Z-电位： Z-电位能近似地代表表面电荷密度的大小 细胞的性

14、质和细胞壁的组成：细胞壁的电荷性质 载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等无机材料,包埋固定法,包理法是在细胞自身并不与凝胶基体发生化学键合的情况下将其包埋在半透性聚合物颗粒（或膜）内的一种固定化方法。包埋法的最大优点是能较好的保持细胞内多酶系统的活力，可象游离细胞那样进行产物的发酵生产。,包埋法常用载体：,琼脂 海藻酸钙 角叉菜胶 明胶 聚丙烯酰胺,举例：海藻酸钙包埋法,基本原理是：称取一定量的海藻酸钠配成水溶液，经杀菌冷却后，与一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷悬液滴入一定浓度的凝固浴中（常用CaCl2 溶液），形成球状固定化细胞。,研究热点光交联树脂包埋法,例：相对分子量

15、为1000-3000的光交联聚氨酯预聚物等，加入1%左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至50，然后与一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外照射3min，就可制得。,第五节 固定化原生质体和辅酶,一、原生质体的制备 二、固定化 三、辅酶固定化,一、原生质体的制备,将对数生长期的细胞收集悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中加入水解酶分离得到原生质体,二、原生质体固定化的方法,将原生质替制备好后，把离心收集到的原生质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液中，配成一定浓度的原生质体悬浮液，然后采用包埋法制成固定化原生质体。,三、辅酶固定化,原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参

16、与酶的催化反应 有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵 工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生,辅酶固定化的方法,固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后固定在超滤器中。 辅酶固定化必须解决辅酶在多个酶之间传递的障碍。,辅酶的固定化,辅酶固定化的形式,第六节 酶反应器和固定化酶（细胞）的应用,酶反应器介绍 反应器选择的依据 反应器和酶稳定性 固定化酶和细胞的应用（工农业、医药、分析化学、酶电极、亲和色谱、环境保护、能源开发、基础理论研究）,一、酶反应器,1 分批搅拌反应器。 2 连续流搅拌桶反应器。 3 连续搅拌桶-超滤反应器 4 填充床反应器 5 循环反应器 6 流化床反应器,定义：用于各种酶进行催