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1、微生物的分离纯化,目的要求,掌握倒平板的方法； 掌握几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。,微生物分离培养技术,平板划线分离法,混合倒平板分离法,单孢子或单细胞分离法,选择性培养基分离法,平板涂布分离法,平板划线分离法,用接种环无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,平板涂布分离法,吸取0.1ml菌液接种在琼脂平板上，用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,混合倒平板分离法,将适当稀释的菌悬液lml放入空平板中，倒入已融化并冷却至4550
2、的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。如果样品稀释适当的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养 。 在显微镜下使用单孢子分离器进行机械操作，挑取单孢子或单细胞进行培养。也可以采用特制的毛细管在载玻片的琼脂涂层上选取单孢子并切割下来，然后移到合适的培养基进行培养。,选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。,微生物
3、纯培养分离方法的比较,分离方法,应用范围,平皿划线法,方法简便，多用于分离细菌,混合倒平皿法,既可定性，又可定量，用途广泛,单细胞挑取法,局限于高度专业化的科学研究,选择培养基法,适用于分离某些生理类型较特殊 的微生物,平皿涂布法,既可定性，又可定量，用途广泛,实验器材,样品：桂子山土壤样品。 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。,一、平板划线法操作步骤,1、倒平板 2、样品稀释 3、平板划线,倒平板,在微波炉中加热将灭好菌的固体培养基融化，待冷却至5560C时，右手持装有培养基的三角瓶置酒精灯火焰旁，
4、用左手将瓶塞轻轻拔出，瓶口对着火焰；用右手小指和手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在酒精灯火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布。,样品稀释,准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液
5、；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释的土壤悬液。,样品稀释,平板划线,在酒精灯火焰附近，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环，在平板上划线。 划线方法有：平行划线和连续划线。,平行划线法,连续划线法,划线平板菌落生长状况,二、平板涂布法操作步骤,1、倒平板 2、样品稀释 3、平板涂布,平板涂布,用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上2030min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养。,三、混合倒平板法操作步骤,1、样品稀释 2、混合倒平板,混合倒平板,将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至4550的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。,
