基因工程和基因组学 简介.

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1、1,转基因烟草 荧火虫荧光素酶,第九章 基因工程和基因组学,1基因工程和基因组学的概念和应用； 2内切酶的类别和作用； 3重组DNA； 4基因的分离和鉴定； 5基因组图谱的构建和应用； 6后基因组学。,本章重点,3,果蝇转基因 半乳糖苷酶,第一节 基因工程,广义遗传工程： 生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、 细胞器工程、基因工程及酶工程等。 狭义遗传工程： 基因工程（重组DNA技术）。,一、基因工程概述:,.概念： 基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式 按照预先设计的蓝图 借助于实验室技术将某种生物 的基因或基因组转移到另一生物中去 使后者定向 获得新遗传性状的一门技术。 基因工

2、程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大 变革。,2内容： 从细胞和组织中分离DNA； 限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段； 将酶切DNA分子与载体DNA连接 构建能在宿主细胞内 自我复制的重组DNA分子； 把重组DNA分子引入宿主受体细胞 复制； 重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞 建立无性 繁殖系（clone）或发育成个体； 从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系 并使外源基因 在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收； 或筛选出获得定向性状变异的个体。,3. 发展： 1971年 史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的 一种限制性酶 酶切病毒DNA分子，标志

3、着 DNA重组时代的开始。 1972年 伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒 和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接 起来 得到新的DNA分子。 1973年 科恩（Cohen S.）等进一 步将酶切DNA分子与质粒 DNA连接起来，并将重组 质粒转入E. cloi 细胞中。,1982年 美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在 细菌中生产人的胰岛素投放市场。 1983年 转基因烟草和马铃薯获得成功。 1994年 延熟保鲜的转基因番茄商品生产。 1997年 克隆羊“多莉”诞生（苏格兰 科学家利用6岁成年母羊乳腺 细胞）。,1998年 美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3

4、代共50只实验鼠。 2000年 美国用无性繁殖技术克隆猴子 “泰特拉”，意味克隆人体已无 技术障碍。 2001年 美国宣布首次克隆成功处于早 期阶段的人体胚胎。 2002年 法国研究者宣布克隆出第一个 女婴，但一直未获得证实。,2002年 美国克隆体细胞克隆猫。 2003年 意大利克隆成功克隆马“普罗梅泰亚”（世界上首次由哺乳动物生下自己的克隆体，是母女、姐妹关系） 。 2003年 12月美国德州农业机械大学 宣布克隆成功白尾鹿。 2005年 韩国克隆狗斯努皮Snuppy。,2007年 中国克隆哥廷根小型猪。 2009年 西班牙克隆布卡多野山羊（2000年绝种），绝种前用液氮冷冻保存耳朵皮肤细

5、胞 在近亲动物的帮助下，可能可以复活已灭绝的猛犸和袋狼等珍稀物种。,转基因技术近年来发展迅速： 1983年世界首例转基因烟草培育成功（Calgene公司），标志着人类利用转基因技术改良农作物的开始； 1986年5种转基因材料进入田间试验； 1994年美国批准耐储藏转基因番茄进入市场；现已有 许多转基因产品被批准在生产上使用。,全世界转基因作物总面积,从1996年至2008年的累计种植面积超过8亿公顷,1996年全世界转基因植物种植面积为170万ha，1997年为1100万ha，1998年2780万ha，1999年3990万ha，2000年4420万ha，2001年5260万ha，2005年90

6、00万ha，2008年1.2亿ha。,2008年全世界主要转基因作物的种植面积和比例 （百万公顷）,2007年： 美国（5770万hm2，53%）、阿根廷、巴西、加拿大、 印度、中国（390万hm2）、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律 宾、澳大利亚、罗马尼亚、墨西哥、西班牙、哥伦比亚、 法国、伊朗、洪都拉斯、捷克共和国、葡萄牙、德国、 斯洛伐克等23个国家近1030万农户种植了转基因植物 全球1.143亿hm2（占全球15亿hm2的8%）。 美国、阿根廷、巴西、加拿大 4 国的转基因种植面积 占全球的90%以上。,各国转基因作物种植面积比较,涉及转基因性状： 抗除草剂：主要为转基因大豆、玉米、棉花、

7、 油菜，5860万hm2，约占全世界转基因作物的72%； 抗虫：主要为转基因玉米、棉花，1560万hm2， 占19% ； 抗除草剂 抗虫：主要为转基因玉米、棉花 680万hm2，占9% ； 其它：抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗逆境、 品质改良以及生长发育的调控、提高产量等。,2009年种植面积1.2亿公顷的转基因作物： 大豆：占种植面积的75%， 均为抗除草剂大豆； 玉米：占种植面积的26%，抗虫、抗除草剂； 棉花：占种植面积的20%，抗虫、抗除草剂； 油菜：占种植面积的15% ，抗除草剂； 其它：水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯、 番茄、烟草、南瓜、木瓜、番木瓜、草坪草等。 主要分布

8、: 美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度、中国、 澳大利亚等。,至2008年，我国已经批准商业化种植的产品有25种， 其中1种转基因大豆、8种转基因玉米、1种转基因番茄、 7种转基因油菜、2种转基因棉花，以及改变花色矮牵牛、 抗病毒甜椒等转基因植物。,转基因棉花已大规模种植。2009年， 转基因水稻和玉米已批准商业化生产。,1. 限制性内切酶（restriction enzyme）： 一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。 细菌细胞中存在限制修饰系统： 限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。 修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。,二、 限制性内切核酸酶：, 限制性内切

9、酶如：EcoR I、Hind III：,酶切方式： 以交错方式切断 DNA双链，产生二个 相同单链粘性末端。 重组过程： 两种片段在适宜 条件下，可经磷酸二 脂链，连接成重组 DNA分子。,限制性内切酶的类别： 第类酶（切割部位无特异性）：如 EcoB（大肠杆菌B株）、EcoK（大肠杆菌K株）分子量 较大（约300000），作用时需ATP、Mg+等辅助因子。 第类酶（切割部位有特异性）：如 EcoR I（大肠杆菌）、Hind （嗜血杆菌），分子量 较小（约20000100000），作用时需Mg+存在。,限制性内切酶的命名： 根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示； . EcoR I 来自大

10、肠杆菌（Escherichia coli）； . Hind 来自嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）。,第类酶特点： 切割产生平齐末端（blunt ends），如Sma I：, 有的产生粘性末端（sticky ends），如BamH I、 Pst I 、 EcoR I、Hind ： 识别特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，又 称反向重复序列，从两个方向阅读其序列相同的序列）。,部分常用的限制性内切酶,将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。 DNA片段 适合的载体DNA 重组DNA 在 载体DNA的运载下，进入宿主细胞，并在其中复制。 DNA载体：质粒、噬菌体

11、、病毒、细菌或酵母 菌人工染色体等。,三、载体（vector）：,载体的条件： . 具有复制原点，能自我复制； . 具多克隆位点（multiple cloning site，MCS 或polylinker region）， 即有多种限制酶的切点； . 选择时的遗传标记，如抗生素 基因； . 易从宿主细胞中回收。,pUC19质粒,、细菌质粒： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。 质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA 片段。 在细胞内的复制程度： 严紧型：一个细菌细胞内质粒数量有12个； 松驰型：每个细胞内有2060个。,如p

12、UC18具有以下特点： . 分子量小，可接受较大外源片段； . 拷贝数多，500个细胞； . 克隆位点的酶切位点多，克隆 方便； . 具有用于检测重组质粒的选择 标记（互补的显色表型） 。,、噬菌体（温和型）： 基因组全长为49kb。 噬菌体DNA中间约2/3的序列 为中间基因簇，两端为DNA左、 右臂。中间基因簇可被外源DNA 替代而不影响侵染细菌能力。 能接受15kb外源DNA片段 作为cDNA或核DNA克隆载体。 优点： 不易引起生物危害，有助于 “目的”基因进入细胞并增殖； 携带大片段外源DNA分子， 占总量25%时仍不失活。,、柯斯质粒（cosmid）：,噬菌体DNA 部分细菌质粒D

13、NA序列 柯斯质粒。 有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。,这种质粒分子量较小， 但可接受长达50kb的外源 DNA片段克隆真核生物 基因。 一个长片段DNA可能 具有真核生物基因的编码 序列及其它调控序列。,指能在两种不同生物中复制的载体。如能在原核生物 （如E. coli）、真核细胞（如酵母）中复制的载体。 穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制 序列（Auto-nomously replicating sequence, ARS）以及两者 的选择标记。 穿梭载体在细菌中用于克隆、 扩增基因，在酵母中用于基因表达 分析。 酵母菌的YEP （yeast episo

14、ma plasmid）等系列载体均是穿梭载体。,、穿梭载体（shuttle vector）：,、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）： BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子 改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。,特点： 带有外源DNA的BAC载体在 细胞中是单拷贝的； 载体分子量很小（7.4kb）； 选择标记：氯霉素抗性基因； 多克隆位点。,、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）：,1996年完成了酵母菌 全基因组序列的测定。,YAC具有自主复制序列、克隆

15、位点和可在细菌和酵母菌 中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受 1001000kb的外源DNA片段。 YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具； 并促进了人类人工染色体（human artificial chromosome， HAC）的研究。,、Ti质粒及其衍生载体：,适合于植物的载体系统将重组DNA运载到植物细胞中 目的基因表达。 Ti质粒（细菌质粒）：存在于土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴性菌）细胞 可诱导植物产生瘤细胞 （tumor-inducing, Ti）冠瘿瘤（grown galltumors）。,Ti质粒有一部分转

16、移DNA（transfer DNA，T-DNA）当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 （opine），作为农杆菌 碳源和氮源。,农杆菌 感染产生 冠瘿瘤,Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： . T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； . 质粒转移区（PT）； . 冠瘿碱（opine）代谢区； . 复制原点； . 毒性区。,2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界（RB），左端的序列称为左界（LB）。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因以顺式 及反式两种方式控制T-DNA转移。,一般而言，一个基因 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子、外显子