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1、第五章 色谱分析导论 Chromatography,第一节 概述 Introduction,色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同而达到分离目的的。,一、历史,Tswett 研究植物色素分离，提出色谱法 概念；,t,s,1941 Martin和Synge提出液-液色谱理论；,1952 James和Martin发展了气相色谱；,1956 Van Deemter提出速率理论；,1967 Kirkland等研制高效液相色谱法；,80年代以后 出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。,色谱法的基本特点是具备两个相：不动的一相，称一为固定相；另一相是携带样品流过
2、固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。（一次）,色谱法分类,1按两相状态分类 气体为流动相气相色谱（GC）：固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的液膜），又可分为气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）。 液体为流动相液相色谱（LC）。液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和液液色谱（LLC）。 超临界流体为流动相的称为超临界流体色谱（SFC） 通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键
3、合相色谱（CBPC）。,2按分离机理分类,组分在固定相上的吸附能力强弱不同吸附色谱法。 组分在固定液（固定相）中溶解度不同分配色谱法。 组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同离子交换色谱法。 利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。 组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质分离。,3按固定相的外形分类 固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。,根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表,52 色谱流出曲线及有关术语 一流出曲线和色谱峰,二、基线,是柱中仅有流
4、动相通过时，检测器响应讯号的记录值，即图183中Ot线。稳定的基线应该是一条水平直线。 三、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示，如图183中BA,四、保留值,1死时间tM 不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间， OA。因不被固定相吸附或溶解，故其流速与流动相的流动速度相近。测定流动相平均线速时，可用柱长L与tM的比值计算。,2保留时间tR 试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为保留时间，如图18-3 OB。它相应于样品到达柱末端的检测器所需的时间。,3调整保留时间tR 某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间，即
5、 tR = tR-tM,由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以tR实际上是组份在固定相中停留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留体积等参数进行定性检定。,4死体积 VM 指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与流动相体积流速F0（Lmin）计算： VM = tMF0,5保留体积 VR 指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。
6、保留体积与保留时间t。的关系如下： VR = tRF0,6调整保留体积VR 某组份的保留体积扣除死体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR = VR- VM,五、区域宽度 色谱峰的区域宽度是组份在色谱柱中谱带扩张的函数，它反映了色谱操作条件的动力学因素。度量色谱峰区域宽度通常有三种方法：,1. 标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半，如图18-3中EF距离的一半。 2. 半峰宽W1/2 即峰高一半处对应的峰宽，如图18-3中GH间的距离。它与标准偏差的关系是： W1/2 = 2.354,3. 基线宽度W 即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距，如图183中IJ的距离。它与标准偏差的关系是
7、： W = 4,从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息,（l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组份的最少个数。 （2）根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。 （3）根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分析。 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据。,相对保留值2.1 某组份2与组份1的校正保留值之比，称为相对保留值：,由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关。,选择因子 定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留
8、值。在多元混合物分析中，通常选择一对最难分离的物质对，可用符号表示：,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：,式中：C不同时间t时某物质的浓度，C0进样浓度，tr保留时间，标准偏差。,5-3 色谱法分析的基本原理 色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从
9、热力学和动力学两方面来研究色谱行为。,（5）分配系数和分配比（容量因子）,分配系数： 一定温度与压力下两相达平衡后， 组分在固定相和流动相浓度的比值,分配比（容量因子）： 一定温度与压力下两相达平衡后， 组分在固定相和流动相量的比值,固定相重量 流动相重量,K与k的关系：,（6）容量因子k与保留值的关系,组分在两相中的质量比等于组分在液相中的停留时间与气相中的停留时间之比,色谱基本保留方程,四、分离效能指标,1、选择性（相对保留值）,相对保留值由两组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关。,2、峰宽度,3、分离度,分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：,R 1.0 两峰明显重叠 R
10、 = 1.0 两峰达97.7%分离 R 1.5 两峰完全分开,二、塔板理论 最早由Martin等人提出塔板理论，把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，同时引人理论塔板数作为衡量柱效率的指标。,该理论假定： （i）在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。 （ii）以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（Vm）。 （iii）所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。 （iv）分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。,下表列出经过各级转移
11、后组分在每一级塔板中的量：,当经过1次转移（N=1）以后：,第0级塔板：r = 0,组分的分量 =,若抽象成一个规律：,由上表可以看出，经N次转移后，组分在各级塔板上的量符合二相式分布，即,当N = 4时，组分分布在5级塔板上：,以A组分为例，5级塔板上的分量分别是：,对于两个组分A和B，如果k不同，则流出曲线的形状不同：,由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，,可知：,m为组分质量，Vr为保留体积，n为理论塔板数。 当V=Vr 时，C值最大，即,或：,n 称为色谱柱的理论塔板数。 因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。,从上两式可以看出，色谱峰W越小，n
12、就越大，而H就越小，柱效能越高。因此，n和H是描述柱效能的指标。 通常填充色谱柱的n103，H1mm。而毛细管柱 n=105-106，H0.5mm 由于死时间tm包括在tr中，而实际的tm不参与柱内分配，所计算的n值增大，H很小，但与实际柱效能相差甚远。所以，提出把tm扣除，采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。,理论塔板高度（H）,塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置，还提出了计算和评价柱效的参数。但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程，例如，纵向扩散不
13、能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素，也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数，这就限制了它的应用。,三、速率理论,1、塔板理论的不足 塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。,2、Van Deemter方程 1956 年荷兰学者范弟姆特 等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔板理念的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度 H 与载气线速度 u 的关系： 其中 A 涡流扩散项 , B 分子扩散项， C 传质阻力项。,式中 u线速度,表明 A 与填充物d
14、p 的大小和填充的不均匀性 有关，而与载气性质、线速度和组分无关，因此使用适当细粒度和颗粒均匀的担体，并填充均匀，是减少涡流扩散，提高柱效的有效途径。,涡流扩散示意图,(2) 分子扩散项 B/u 由于试样组分前后 ( 纵向 ) 存在着浓度差而形成浓度梯度，因此使运动着的分子产生纵向扩散。 B=2rDg r 是因载体而引起气体扩散路径弯曲的因数 ( 弯曲因子 ) ，与填充物有关； Dg 为组分在气相中的扩散系数。与组分及载气的性质有关：相对分子质量大的组分，其 Dg 小 , 所以采用相对分子质量较大的载气 ( 如氮气 ) ，可使 B 项降低， Dg 随柱温增高而增加，但反比于柱压。弯曲因子 r 为与填充物有关的因素。,(3) 传质项系数 Cu C 包括气相传质阻力系数 Cg 和液相传质阻力系数 Cl 两项。 所谓气相传质过程是指试样组分移动到相表面的过程，在这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。这种过程若进行缓慢，表示气相传质阻力大，就引起色谱峰扩张。 液相传质过程是指试样组分从固定相的气液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后以返回气液界面 的传质过程。,怎样找最佳流速？,影响谱带展宽的其它因素 柱前展宽、柱后展宽、柱外效应,
