感受态细胞制备(三种方法)

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1、方案23制备和转化感受态大岛抨商的H.anahan方法:高效的转化策略 87 方案23制备和转化感受态大肠杆菌的Hanahan方法: 高效的转化策略 20世纪70年代晚期和80年代早期，00吨Hanahan在玲泉港实验室和哈佛大学做 研究生的时候，他做出了以前从未昕说过的转化效率，并且在以后他的方法被标准化 了。Hanahan开一辆快车，而且总是带有神秘感地在夜里工作，他从来讲过给他带来神 奇结果的缓冲液的成分。然而.他无偿和慷慨地把这种缓冲液提供给了需要进行高效转 化实验的每一个人。在东海岸80年代早期产生的许多质量上乘的cDNA文库都是用 Hana.han的缓冲液构建的。Hanahan的缓

2、冲液闪烁着美丽的色彩因而以“液体黄金“闻 名。 最终，掖悻黄金的配方发表了，而且带有如何实现高效转化的详细说明(Hanahan 1983)。 如果做得很细心，用Hanahan的方法可以重复性很好地制备出效率很高的大腼抨 菌感受态细胞(5)(10 8 个转化菌/阅超螺旋质桂DNA)。这里关键是仔细，严格准确地 按照Hanahan的指导一切都将收利。取捷径，用不净的容棉、不纯的水或陈旧的试剂 那肯定要失败。这也许可以解释.为什么某些研究者总是不能重复出Hanahan的结果。 有三个关键因素是采用Hanahan方法并按得与其一致的高效转化率必须注意的; 所周转化缓冲淡的试剂能皮用高纯度的水和二审亚飘

3、(DM)制备庸受 态细胞是最重要的(Hanahan1985)，包括细菌培养基成分在内的某些试剂会随 着储存期的延长而降低效能。无论何时，尽可能使用新买的试剂和生长培养基。 如出现问题，每种试剂，如DMSO、DTI、甘油、MES等，应逐一在转化操 作中予以替换，以查明某一批号试剂的质量以及对转化效率的影响。 细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存 于一70t:的储备菌中直接培养获得的，因此，不应使用在实验室中连续传代或 存放于4t或室温的培养物。 玻h岛和塑耕嚣皿的清洁微量的洗搔剂或其他化学物质舍大幅度地降低细胞 转化妓率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其

4、他目的的玻璃 容器，这些玻璃器皿应用手来刷挠，并且用纯水(Mini-Q水戎相当的水)充 满，再经高温高压消毒。水在玻璃器皿使用前应倒掉。注意:很多手工操作后 用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗襟剂的。 Han血m方法适用于很多分子克隆中常用的大腼抨菌.如DH1，DHS、MM294、 JMI08/109、DH缸，还有很多其他的株系。但也有一些株系的大肠杆菌(如MCI061) 不能采用这个方法，有关的细节以及这个方法如何用于其他细菌，见Hanahan等 (1991, 1995)。转化的其他方法将在方案24(超级感受牵细胞的制备)和方案25(氟 化钙的转化方法)中介绍。 . 88

5、第1章质植及其在分子克隆巾的应用 材料 注意=对于标记(!)的试剂的操作，请参且硝录12. 缓冲液和溶液 贮带液、冲液鞠试剂成分清见附录1.应用时串串贮存穰稀释至适当浓度. 二甲亚枫DM目)(0 二甲亚鼠的氧化产物据推测为工甲幢幢，是转化的抑制衡， 阳山培班(DMSO和 U口) 旷盯二撞苏糖醇)1.53g DMSO 9 ml 1 mol/L乙艘甲(pH7.5)100 HO 补歪10皿1 DnD糟被周可耐受有机榕剂的M泊阻SR膜(Milli阳时过lJl除菌，将岛D糟被分装成1i小份放入 0.5 ml的元菌微量离心管中.曹封管口，贮存于-20C. 转化缓冲玻(请见步.1) 标准的转化侵棉被(TFB

6、)一般现用现配。冻存的缓冲液(F回)周末E库存(-70t)感受牵细胞e 培养基 SOB琼脂板含20tnmol/L MgSO“和适量的抗菌素 标准的国B琼-ti含10m皿ol/LMg剑)40 50S培养基舍20mmoVL MgS04 标准的SOB培养基含10mmo1IL MgS040 S倪培养基 每次转化反应需1ml的叹兀培养墓。 核酸和寡核昔酸 质粒DNA(重组质粒) 2蓝本章1f*17-22所提供的方法梅 离心机和转头 Sorvall GSA转头或与之相当的转头 专用设备 液氮t处理去离子水。 制j备括准转化缰冲灌 a. 1 moVL的MES缓冲液的配制z将19.52gMES蒂于回ml纯水(

7、Mlli-Q级， 或与之相当级别的)中，用5moI/L的KOH调pH至(i.3，最后用纯水定容至 100时，用预先处理的Nalgene滤膜(0.45问E孔佳)过由除菌。以10ml/份分 装，于-20t保存。 b. TBF槽糟的配制r将下表列出的成分溶解于5ml水中，然后加10mll moVL 的MES缰冲液(pH6.3)。最后用纯水定容至lL。 lL TBFiW滩的配制 试剂所需麓/L 哥浓度 1 moVL MES (pH6.3) 10 ml 10 mmoI/L MnCI2.4B20 8.9匾45 InrnoVL Cl22B;且O1.47g 10 mmolIL K 7.46g 1mmol/L

8、氧化六氨合高锚0.80(01 3 mmol/L H20 加至lL c. TFB槽被用预先处理的Nalgene撞器(0.45m孔径)过滤除菌，接咄咄/份分 装成小份贮存于组织培养瓶(Comir毡，或与之相当的瓶中，并置于4t保存。 90 第l章质粒及其在分子克隆中的应用 制备冻存缰冲渣 a.将9.82g乙酸饵溶于90ml纯水(Milli-Q级或与之相当银别的中制成lmoI/L 的乙酸饵，然后用2moI/L乙酸调pH值至7.5.加纯水至终体积为100时，将 溶液分成小份，贮存于-20c。 b.配制FSB帮擅2用500ml纯水将下表列出的所有成分禧解，待试剂溶解后，用 0.1 mol/L的H调pH值

9、至6.4。如调过头，不要用碱重澜，而应弃去糟液重 配。用纯水将体积补至lLo lL FSB鸿波Ii!J 试剂所需量IL浓度 1 molIL Z破.，(pH7.5) 10 mI 10 mmoL MI1.4日208.91g 45 mmoI/L ca22日201.47, 10 mrr时/L KCJ 7.46(1 100 IU町10L 氯化六氯合钳0.80, 3 mruoI/L 甘曲100 ml 10% V/V) 比0加至lL C.溶液用预先处理的Nalgene撞膜(0.45m孔径)过撞除菌。分装成40 ml小份， 装入组织培养阳(Corni咱或与之相当的辄)中贮存于4t: 。贮存期间，槽糠的 pH值

10、将会下降至6.1-6.2。此后，pH值将稳定不变。 2.用无菌接种环直接从陈存的大肠杆菌贮存液中所需的菌种在SOB琼脂板表面划线， 于37t培养16ho 没有必要将$“存菌融化.f良种环划过*存自衷商所榕的自已经足惨了.一管*存“可以用多次， 3.将4-5个分隔良好的商落转移到1mL含20mmoVLMg灿的SOB中。中速提葛使 细菌分散，然后在lL锥形瓶中用30-100ml含20mmol/L MgS04的SOB稀菁培养 物。 4.于37t将细菌培养2.5-3h.监测培养物的生长情况。 为达到高效转化，活细胞tt务必少于10细胞/ml对于大多数大局桥商来说，这相当于0马“值为0.4左 右。为保证

11、细“清养衡的生*“度不致过商.可每隔15-20min测定臼马，但来草测.用监测的时向0.4)(Hunalum 1983)，另-个在末期(0马回=0.95) (Tj、份感受态细胞的量可能需要加大些。 不用玻璃皆是因为官们会降低转化妓率约10倍。 在存感曼在细胞的制备 a.每4 ml重量细胞班加140lDMSO，轻轻旋转樨匀立，将悬掖置冰上15mino b.每份细胞悬鞭再加1401DMSO，轻轻旋转蝇句之，置球1:15 mln., C.迅速将悬掖分装到恃却的无菌徽量离心管或组织培养管中，封紧啻口，世人榷 氧中快速冻感受态细胞。贮存于甲70c备用。 就大多数克隆方面的用途来说150 “，1感受态细胞

12、悬液己绰绰有余了。然而，棚“要更大量的转化回 落(如构建cnNA文库).每小份感曼态细胞的量可能需要加大些。 d.需要时，从-70c球箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。细 胞一经融化，立即把管转移至nJ浴中，在冰上放置1omin e.用一玲的无茵吸头把感受态细跑转移到冷却的无菌聚丙烯管(1口7X17，切Omm)中 政置在陈椅上。 不用玻璃管是因为它何会降低转他效率约10倍。 转化 包括阳性和阴性对照(见专栏“细菌转化“) 13.将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50l感受态细胞需25ng . 92 第1章质粒及其在分子克隆中的应用 DNA) ，体积不应超过感受态细胞

13、的5%，轻轻旋转几次掘匀内容物。实验中至少 设两个对照管:一个含有感受态细胞和已知量的超螺旋质植DNA，另一管只有感 受在细胞。嘱勾内容脚，冰陪30mino 14.将管放入面却握至42t的循环水中，恰恰放置90s，不要摇动管。 锦磁是一个关键步骤，准确地达到热激植皮非常豆耍。这星的温度及温育的时闸都是使用Faloon2059管 的测量参缸，其他典型的管将可能按得不阉的结果. 15.快速将管转移到*袖中，使细胞玲却1-2mino 16.每管加8001soc培养基，用水陆将培养基加温至37t，然后将管转移到设置为 37 c的摇床上，强育45min，使细菌复苏并表达质桂编码的抗生素抗性标记基因。 为

14、最大限度地畏高转化率.复苏期中应温和地摇勘细胞(NA文库).每小份a摩登态细胞的量可能儒要加大垫。 14.需要时.从-70t冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。细胞 96 第1章质位及其在分子克隆中的应用 一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10minc 15.用一峙的无商暖头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管(17x 170mrn)中，放 置在冰浴上。 不用玻璃管是因为官们会降低转他效.约10倍。 转化 包括阳性和阴性对照(请见方案23中的专栏“细菌转化“) 16.将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50!感受态细胞需 25ngDNA).体积不应超过感受态细

15、胞的当%，轻轻旋转几次混匀内容咽。实验中 至少设对照管=一个含有感受态细胞和已知量的起螺旋质粒DNA.另一管只有感 受态细胞。混匀内容物，冰浴30min。 17.将管融入预加温至42c的循环水播中，恰恰放置90s，不要摇动。 热激是一个关键步瓢，准确地达到l热.温度非常重要。这垦的温度及温育的时间都是使用FIllnZ059臂 的测量参数，其他类型的管将可能获得东网的结果。 18.快速将管转移到冰浴中，使细胞玲却1-2m;no 19.每管加8001SOC培养基，用水槽将培养基加温至37t，然后将管转移到设置为 37 t的摇床上，温育45min.使细菌复都并表达质位编码的抗生素扰性标记基因。 为最

16、大限度池提高转化率，复苏湖中应植和地撼动细胞(109个转化子111氯仿萃取和乙圈，沉陡的途径提取DNA.沉淀的DNA要用70I乙.诲，而后用TE(pH8.0) 或比011解，浓度应在1-10!Wml. 对于构建文库.高的事曹化效事是必需的，而共转化则是要适量兔的。DNA的总浓度应低于10且g/ml(勘啊 ef I,!t 111. 1988).用越螺旋质量转化E.toli，常规转化10-50降的DNA蠢it足够了.如果是用I宠庸的质拉 选行转化.应将连接产物辙“至浓度为2S吨的DNAo 14.调节电击仪，使电脉冲为25间，电压25kV，电阻200n。 15.将细菌与DNA1昆合物加至岭的电击杯内，轻击液体以确保细菌与DNA悬掖位于电 击杯底部。攘干电击槽外的冷凝水和雾气。将电击杯放进电击仪。 16.按上述设定的参数.启动对细胞的电脉冲。仪棒应显示出4-5ms具有12.5kV/cm 的电场强度。 电击杯闹的离子可增加攘攘的电导，并在含