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1、细胞及组织培养的 准备工作,实验内容介绍,实验一、细胞及组织培养的准备工作 实验二、培养基及胰酶的配制 实验三、细胞的传代（I）与冻存 实验四、细胞复苏及细胞鉴别与计数 实验五、细胞原代培养 实验六、细胞传代（II）细胞爬片 实验七、细胞骨架组分的荧光染色观察 实验八、考试动物细胞培养技术,实验内容介绍,实验九、动物细胞的转染与GFP的RNA干扰技术 实验十、利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数 实验十一、探究实验（综合设计实验） 实验十二、探究实验（综合设计实验） 实验十三、扫描电子显微镜简介 实验十四、扫描电子显微镜生物样品制备及观察,课程要求,一、遵守实验室的各项规定 二、仪器使用要
2、遵守操作规则 三、上课不迟到、不早退、不无故旷课 四、上课时必须穿实验服 五、服从研究生助教的指导和安排 六、按时完成作业 七、保护实验环境、爱护实验动物 八、实验结束后，及时清理实验用品,实验考核方式,平时成绩 60 %，期末考试40 % 平时成绩：课堂操作，实验习惯，合作精神， 实验报告，课堂互动 期末考试：组织培养技能考核：辨认细胞 实验操作 总结报告：自主创新实验收获 科研小论文,实验一、细胞及组织培养的准备工作,什么是细胞及组织培养？,一、实验原理,1.体外培养（in vitro culture) 的基本概念: 将活体结构成分（甚至个体）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境
3、的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为地分为： 组织培养（tissue culture） 器官培养（organ culture） 细胞培养（cell culture),一、实验原理,组织培养(Tissue Culture)是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。 细胞培养(Cell Culture)是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。 器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持
4、一定功能的方法。,一、实验原理,2. 组织细胞培养的优点 能够长时间观察细胞的生命活动 容易控制实验条件，有利于生物学研究 容易直接采集细胞及亚细胞结构的图象 便于各种细胞染色处理和标记 培养细胞的单一性，有利于排除干扰因素,一、实验原理,3. 体外培养技术的应用： 基础研究：细胞生物学乃至整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培养的组织或细胞是良好的实验材料。细胞培养广泛应用于现代医学和生物科学研究之中 生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段。,细胞及组织培养的基本条件是什么？,一、实验原理,4. 细胞及组织培养的基本条件 （1）无污染的环境条件 （2）适当的温
5、度:由酶和蛋白质所需要的最适温度决定,3537(人和哺乳动物细胞) （3）气体环境与pH环境： pH7.2-7.4 (人和哺乳动物细胞) （4）营养条件 （5）其它条件：等渗条件、附着底物,何谓无污染的环境条件？,一、实验原理,5.无污染的环境条件 凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。 （1）细胞污染的种类 A.物理污染: *温度: 解决对策： 孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置 *放射线与辐射:解决对策： 试剂周围不能放同位素尽量不放在带有玻璃门的冰箱中 *振动:解决对策：孵箱周围不能放引起振动的设备 *其他：尘土、玻璃残渣等.解决对
6、策：严格清洗,B.化学污染 水: 解决对策：用双蒸和三蒸水配液和清洗容器 （现在用纯水仪millipore超纯水） 容器: 生产过程中有毒物质残留（铅、砷）;消毒剂和清洗剂的残留;铝箔和包裹纸残留 解决对策：培养用各种器皿的严格清洗（泡酸） 培养箱:CO2混有有毒气体; 消毒剂和清洗剂的残留 解决对策：购置高质量的CO2培养箱擦拭干净,一、实验原理,C.生物污染 细菌、霉菌和酵母:易被发现,易造成隐性污染 病毒: 最难发现和清除,严格的宿主性,自限性 支原体：污染严重,难发现 ,难清除 原虫、昆虫： 其它细胞系： 解决对策：实验用品严格灭菌，无菌操作同一时间只传同一种细胞,每种细胞要有单独的液
7、体。建立细胞库，每三个月更换一次细胞,一、实验原理,6.清洗与灭菌 除去各种玻璃或塑料器皿上对细胞生长有影响的各种杂质以及消除附着在其上的各种微生物及化学物质，改善玻璃表面性质，有利于细胞的粘着和生长。 清洗和消毒是否彻底直接关系到体外培养的成败。,（1）清洗 玻璃器皿：培养瓶、吸管、滴管 、试管等 浸泡 刷洗、烘干 浸酸冲洗（15遍自来水后3遍蒸馏水 倒置烤干 包装干热消毒 胶塞（旧）：用加入适量洗涤灵的水溶液煮沸30分钟，自来水冲洗 蒸馏水漂洗3次 晾干包装 湿热灭菌烘干备用 胶塞（新）：水中浸泡 2%NaOH煮10-20min 自来水冲洗10次 1%HCl浸泡30min自来水冲10次，蒸
8、馏水洗3次 晾干 包装 湿热灭菌烘干备用。 金属器械 ： 自来水洗 75%酒精擦 湿热灭菌、包装 烘干备用或者自来水冲10次，蒸馏水3次 晾干 包装 湿热灭菌烘干备用,一、实验原理,（2）细胞及组织培养用品的包装 1局部包装：滤器，培养瓶口 2. 全包装：胶塞、瓶盖、金属器械、注射器、小的瓶皿等,（3）细胞及组织培养用品的消毒与灭菌 射线消毒: 用钴60等发出的射线消毒灭菌。 适宜用于量大或不适做高压、干热或过滤处理的培养用品，如塑料制品等。 紫外线消毒: DNA损伤，臭氧，双氧水 适用于空气、主要用于培养室空气、操作台、塑料、培养皿和培养板等表面消毒. 【注意事项】：空气消毒时灯管应距地面2
9、5 m以内；台面的消毒应在80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。不要让紫外线照射人的皮肤。,一、实验原理,干热灭菌: 高温变性， 160保温90120 min 适用于玻璃器皿 【注意事项】温度降至100之下才能开烤箱门。,一、实验原理,湿热灭菌:高温变性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分 适用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头 塑料物品、PBS、LB等不易产生沉淀的液体,一、实验原理,过滤除菌：采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，适用于培养基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等对热不稳定的试剂及药物,一、实验原理,化学消毒: 来苏(0.3%)
10、、新洁而灭（0.1%）、乙醇（70- 75%）、乳酸、过氧乙酸(0.5%) 火焰消毒：仅限于无菌操作过程，在火焰近处并经过烧灼进 行。用于培养瓶、滴管、试管、吸管等。 注意：等用品冷却后放可接触活的组织和细胞。 抗生素的抑菌作用：青霉素、链霉素100单位/ mL培养基,一、实验原理,7. 平衡盐DHanks缓冲液的配制 平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）主要是由无机盐、葡萄糖组成。它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 D-Hanks与Hanks的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg
11、2+，因此D-Hanks常用于配制胰酶溶液。 DHanks的配制 配方（1000 mL）：KCl 0.4g；KH2PO4 0.06 g； NaCL 8 g； Na2HPO4.12H2O 0.132 g；NaHCO3 0.35 g；酚红0.02g（2%，1 mL）可不加酚红,一、实验原理,二、实验目的,1.掌握细胞培养的基本概念 2.了解细胞培养的基本条件 3.掌握清洗和消毒的基本方法 4.学习DHanks液的配制方法,三、实验材料,1.细胞培养用品：玻璃器皿；滤器；塑料及橡胶制品 滤膜；棉花；酒精灯等 2. 药品及试剂：KCl ，KH2PO4 ， NaCL ，Na2HPO4， NaHCO3，
12、酒精、新洁尔灭等。,四、实验内容,无菌室及互动显微镜室、仪器的使用规则 清点仪器设备 针头滤器的安装与灭菌：安装滤膜（0.22m光滑面朝上），高压灭菌。 DHanks缓冲液的配制及灭菌处理 练习清洗培养瓶。 练习包瓶子、塞子、插枪头、切盖玻片，移液管塞棉花等。 75%酒精配制、酒精棉球制作以及酒精灯内酒精添加。 配新洁而灭消毒水。 练习培养基瓶盖的开启与盖上 无菌室的打扫：自来水拖地、擦桌子及超净台，然后0.1%新洁而灭擦。 CO2培养箱灭菌：0.1%新洁而灭擦，然后75%乙醇擦。,四、实验内容,D-Hanks液的配置 每组8人配置1000mL，分装80mL*4瓶（原代培养用），分装60mL*4瓶（用于胰酶的配置），其余装入500mL试剂瓶中。高压灭菌。 灭菌，为下周实验做准备。,思考题,1.哪些物品适用于湿热灭菌？那些不适合湿热灭菌？ 2.D-Hanks液在细胞培养中的作用有哪些？ 预习下节课内容,
