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1、液相色谱-质谱联用一、液质发展史1.质谱发展简史质谱作为检测器，具有灵敏度高、专属性好的特点，与其他色谱技术相连接，已广泛的应用于各个研究领域。欲学习液质，我们先了解一下质谱发展的过程19 世纪末，E.Goldstein 在低压放电实验中观察到正电荷粒子，随后 W.Wein 发现正电荷粒子束在磁场中发生偏转，这些观察结果为质谱的诞生提供了准备；1912 年，英国物理学家 Joseph John Thomson 研制出世界上第一台质谱仪（ 1906 年诺贝尔物理学奖获得者、英国剑桥大学教授）；1917 年，电喷雾物理现象被发现（并非为了质谱）；1918 年，Dempster 180磁扇面方向聚焦
2、质谱仪；1935 年，马陶赫(Marttauch)和赫佐格(R. Herzog)根据他们的双聚焦理论，研制出双聚焦质谱仪；1940 年，尼尔(Nier) 设计出单聚焦磁质谱仪，又于 1960 年设计并制成了一台小型的双聚焦质谱仪；1942 年，第一台商品质谱仪；1953 年，由鲍尔(Paul) 和斯坦威德尔(Steinwedel)提出四极滤质器；同年，由威雷(Wiley)和麦克劳伦斯(Mclarens)设计出飞行时间质谱仪原型；1954 年，英格拉姆(Inghram)和海登(Hayden) 报道的 Tandem 系统，即串联的质谱系统(MS/MS)；1955 年，Wiley & Mclaren
3、s 飞行时间质谱仪；1960s，开发 GC/MS；1974 年，回旋共振质谱仪； 1979 年，传送带式 LC/MS 接口成为商业产品； 1982 年，离子束 LC/MS 接口出现； 1984 年，第一台电喷雾质谱仪宣告诞生； 1988 年，电喷雾质谱仪首次应用于蛋白质分析；1989 年，Hens G. Dohmelt 和 W. Paul,因离子阱（Ion trap)的应用获诺贝尔物理奖；2002 年，J. B. Penn 和田中耕一因电喷雾电离（electron spray ionization, ESI）质谱和基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorpt
4、ion ionization, MALDI)质谱获诺贝尔化学奖。2.“接口”技术发展简史 3.液质联用仪发展简史从“接口” 技术发展史来看，液质“接口” 技术的难度要大于气质的，这是因为液相色谱中的流动相是液体，而质谱检测的是气体离子，所以“接口” 技术必须要解决液体离子化难题。伴随这一难题的解决，液质联用的发展也日新月异，并广泛的应用于各领域。1977 年，LC/MS 开始投放市场；1978 年，LC/MS 首次用于生物样品分析；1989 年，LC/MS/MS 研究成功；1991 年，API LC/MS 用于药物开发；1997 年，LC/MS/MS 用于药物动力学高通量筛选；2002 年美国
5、质谱协会统计的药物色谱分析各种不同方法所占的比例。1990 年，HPLC 高达 85%，而 2000 年下降到 15%，相反，LC/MS 所占的份额从 3%提高到大约 80%。我们国家目前在这方面可能相当于美国 1990 年的水平。二、液质仪器基本构造及原理 质谱分析过程：样品通过进样系统进入离子源，将样品离子化变为气态离子混合物，由于结构性质不同而电离为各种不同质荷比（m/z）的分子离子和碎片离子，而后，带有样品信息的离子碎片被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析器中被分离并按质荷比大小依次抵达检测器，经纪录即得到按不同质荷比排列的离子质量谱，也就是质谱(mass spectrum)。质
6、谱的基本结构质谱仪一般由进样系统、电离源、质量分析器、真空系统和检测系统构成。（一）进样系统在液质联用中一般有两种进样方式。第一种是输注，即用注射器泵（syringe pump）将样品溶液直接缓慢输入到离子源。这种方法虽然简便、快速，但是需要相对多的样品，且难以实现自动进样分析。第二种是流动注射，即将样品溶液注入 HPLC 进样系统，由 LC 泵缓慢推动溶剂将样品溶液直接注入离子源。这种方法既简便、快速，样品溶液的用量较小，易于实现自动进样分析。（二）电离源液质联用中最常用的电离源有大气压电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），两者同属于大气压电离（API）技术，其离子化过程发生
7、在大气压下。1、电喷雾(ESI) 工作原理：电喷雾电离(ESI) 是在液滴变成蒸汽，产生离子发射的过程中形成的，溶剂由液相泵输送到 ESI Probe，经其内的不锈钢毛细管流出，这时给毛细管加 24kv 的高压，由于高压和雾化气的作用，流动相从毛细管顶端流出时，会形成扇状喷雾，使液滴生成含样品和溶剂离子的气溶胶。电喷雾离子化可分为三个过程：1）形成带电小液滴：由于毛细管被加高压，造成氧化还原反应，形成带电液滴。2）溶剂蒸发和小液滴碎裂：溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，液滴表面的离子密度越来越大，当达到 Rayleigh (瑞利）极限时，即液滴表面电荷产生的库仑排斥力于液滴表面的张力大致相等时，液
8、滴会非均匀破裂，分裂成更小的液滴，在质量和电荷重新分配后，更小的液滴进入稳定态，然后再重复蒸发、电荷过剩和液滴分裂这一系列过程。3）形成气相离子：对于半径10nm 的液滴, 液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，而不是液滴的分裂，最终样品以单电荷或多电荷离子的形式从溶液中转移至气相，形成了气相离子。ESI 的特点*软电离, 产生准分子离子 正离子：(M+H)+，(M + NH4) +，(M + Na) +，(M + K) +负离子：(M -H)，(M + CH3COO)，(M + Cl)*对很多种类的化合物都有很高的灵敏度*高分子量生物大分子和聚合物产生多
9、电荷离子(M + nH)n+(M - nH)n*低分子量化合物一般产生单电荷离子( 失去或得到一个质子) *高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子*几乎没有碎片离子*可能生成加合物和/或多聚体 常见的是溶剂加合物和 NH4+(M+18), Na+(M+23),和 K+(M+39) 加合物*灵敏度取决于化合物本身和基质2、大气压化学电离 (APCI)工作原理：APCI 电离是在大气压条件下利用尖端高压（电晕）放电促使溶剂和其他反应物电离、碰撞，及电荷转移等方式，形成一个反应气等离子区，样品分子通过等离子区时，发生质子转移，形成了(MH) 或(M-H)离子或加和离子。大气压化学电离可分为以下两个
10、步骤：1.快速蒸发：液流被强迫通过一根窄的管路使其得到较高的线速度，给毛细管高温加热及雾化气的作用使液流在脱离管路的时候蒸发成气体2.气相化学电离( 电晕放电)：通过电晕放电，达到气相化学电离APCI 的特点*软电离，产生准分子离子正离子：(M+H)+，(M + NH4)+，.负离子：(M-H)，(M + CH3COO)，(M + Cl)，*主要产生单电荷离子,几乎没有碎片离子 ,纯气相离子化过程，只产生极少的添加离子*受基质影响较小 (相对于 ESI), 质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响*与 ESI 相比适于极性较小的化合物 , 一般适合分析挥发性化合物，也常分析从中性到极性的化合物*热
11、不稳定化合物可能会发生降解*可能生成加合物和/或多聚体 ; 一般是溶剂加合物及 NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 *流速范围大，从 0.2 到 2.0mL/min ，而不用分流。（三）质量分析器任何质谱仪的基本功能都是分析气态离子。样品的电离过程和蒸发都在离子源中进行。质量分析器分析那些离子，当它们进入检测器时，控制它们的移动，并将它们转化为实际信号。 1、单四极杆质谱仪四极杆工作原理四极杆质量分析器由四个平行的杆组成，DC 和 RF 电压被加载在四极杆上，用于过滤除了某个特定的质荷比数值离子以外的所有离子。四根杆都施加 RF 电压，但是负“” 极杆
12、与正“+”极杆相差了 180 度。杆根据施加的 DC 电压标记了 +和 。当施加某个电压时，只有某个特定数值的质荷比的离子能通过四极杆到检测器中，就算所有的样品都在源中产生离子。当电压变化成其它数值，其他质荷比的离子也能通过。因此，一个完整的质谱扫描就是应用到四根杆上的 DC 和 RF 电压不断的变动。一个精确设定的 RF 和 DC 电压被加载到杆上，该电压允许某个质荷比通过。如果对于 DC 和 RF 电压对来说质量过大的离子将会漂到负极杆，因为 RF 力不足以克服离子动力。当正极杆有一个负电压的时候，质荷比低于所选择的质荷比的离子将会加速而漂到正极杆。这个过程将过滤超过带宽的质量。这个带宽是
13、通过在调谐文件中设定的 DC 和 RF 的比值确定的。施加于杆的 DC 和 RF 电压会改变，这样下一个质量数就可以通过进入检测器。四极杆分辨率这是马修稳定图，是 RF 和 DC 电压的结合图。这张图可以预测给定的离子在四级杆场中是否稳定。对于特定的 RF 和 DC 电压，包含这个点的在质谱区域内的离子将会通过进入四级杆进入检测器。这条扫描线由调谐文件中设置的宽度增益和宽度补偿决定。如果降低宽度补偿，扫描线将会下降，峰宽度将会加宽,分辨降低。如果扫描线被提高，峰宽度将会变窄,分辨率增加。2、多级串联质谱仪三重四极杆为了使用四极杆进行多级质量分析，需要按顺序摆放三个四极杆。每个四极杆有独立的功能
14、：第一个四极杆 (Q1) 用于扫描目前的质荷比范围，选择需要的离子。第二个四极杆 (Q2), 也被称为碰撞池，它集中和传输离子，并在所选择的离子的飞行路径引入碰撞气体（氩气或氦气）。离子进入碰撞池和碰撞气体进行碰撞，如果碰撞能量足够高的话，离子就会分解。碎裂的方式取决于能量、气体和化合物性质。小离子只需要很少的能量，更重的离子需要更多的能量来碎裂。第三个四极杆 (Q3)用于分析在碰撞池（Q2）产生的碎片离子。三重四极杆的扫描模式：1）子离子扫描：MS1 选择了某一特定质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，然后在 MS2中分析。即第一个四极杆在选择性离子监测模式，第二个在全扫描监测模式。2）母离子扫
15、描：MS1 进行全扫描，碰撞池产生碎片离子，MS2 进行选择特定的碎片离子扫描。3）中性丢失扫描：MS1 和 MS2 同时扫描，监测母离子特定的中性丢失。4）单个反应监测：MS1 选择某一质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，MS2 只分析一个碎片离子。此过程产生一个简单的单个离子碎片谱图。5）多重反应监测：MS1 选择某一质量的母离子，碰撞池产生碎片离子，MS2 用于搜寻多个选择反应监测。（四）真空系统 真空系统包含以下元件：前级泵（机械真空泵）、高真空泵（分子涡轮泵或扩散泵）、真空腔、真空规。1、真空腔 真空腔是由铝制成，有出口连接其它的元件或和质量分析器。真空腔由密封圈分成四个阶段，每个阶段
16、的压力逐渐降低。第一阶段压力是 1torr（初级压力大约是 2torr)，第四阶段压力是 10-5torr（高真空）。 真空腔表面是一个平的铝板，覆盖了真空腔顶部大的出口。真空腔的 O 形环可提供必要的密封。表面有螺母将其上紧。2、前级泵 前级泵降低真空腔的压力，以便高真空泵可以运作。它也泵走从高真空泵来的气体。前级泵与真空腔和大涡轮泵的出口连接。前级泵有一个内在的反倒吸阀，帮助防止在断电时倒流。 前级泵装有一个油肼和一个油返流管，这个返流管可以将捕集的油排回泵。一个软管将前级泵的废气放空到外面或者烟囱。机械泵在系统中降低真空至 10-1 到 10-2 torr。它也作为高真空的”后备泵” 。 前级泵通常是灌满油的机械泵。这个泵一段时间就需要维护，需要更换泵油、过滤器。在维护时，总是确保出
