atp生物荧光技术在生物学领域中应用的研究进展

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1、 ATP 生物荧光技术 在生物学领域中应用的研究进展 李瑜 田斌 （大连水产学院 生命科学与技术学院 辽宁大连 116023） 摘 要摘 要：ATP 生物荧光技术在生物学领域中的应用广泛：应用于微生物学、分子生物学、以 及细胞学等学科中。利用 ATP 生物荧光技术原理，可用于多种生物检测，解决一些其它分析 方法不能解决的问题。例如，根据 ATP 与荧光强度的线性关系，测定微生物释放出的 ATP 从而进行微生物定性定量的分析测定。以及荧光素酶作为发光标记在核酸领域中的应用。 关键词关键词：ATP 生物荧光技术; 生物发光; 微生物检验; 发光标记; 基因突变 前言前言： ATP生物荧光检测是基于

2、生物发光体系的发光机理所设计，生物体发光细 胞内具有特殊的发光物质荧光素及荧光素酶，荧光素易被氧化，它在荧光素 酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁到高能级，处 于不稳定的激发态(LuHAMP)，当电子跳回到低能级时，即发出荧光光子(Hr)。 由于ATP能不断提供能量， 因而荧光素分子不断地被激活， 即可连续地发出荧光， 其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系 1，2， 通过用发光光度计， 可以 检测出待测液中ATP含量，该法灵敏度极高，可检测出 10ug样品中的 10-11 g ATP 含量。 3 上述特性决定了荧光素酶与ATP能构成很好的生物传感器 4， 用于

3、多种生物检 测，可解决一些其它分析方法不能解决的问题。例如，在临床医学、法医学、环 境监测、制备广谱的酶联免疫试剂及生命科学研究(胞内机制的研究，抗体活性 鉴定，宇宙生物学的研究)。因此，深受世界各国的重视。 5 一、生物发光体系一、生物发光体系 5 生物发光是发生在生物体内的化学发光现象。北美荧火虫体内的荧光素荧 光素酶是最著名的生物发光体系。这个反应的发光机理已研究了近 40 年，但仍 有一些环节不清楚。一般认为是在ATP和Mg2+存在下，荧光素酶与荧光素结合生 成复合物，复合物在氧气作用下氧化生成一个过氧化物中间体，然后分解生成激 发态的羟基荧光素而放出光子(图 1)6 ，7。 反应中复

4、合酶起到提高光发射强度和延 长发光时间的作用8。 作用机理如下 9： 荧光素+ATP+O2氧化荧光素+AMP+PPi+CO2+h 荧光素酶Mg2+ 化学反应方程式： 图图 1 荧火虫荧光素 荧火虫荧光素 荧光素酶体系的发光反应机理荧光素酶体系的发光反应机理 生物发光体系的特点是发光效率、灵敏度、选择性均非常高。例如，荧火虫 荧光素酶体系是已知生物和化学发光体系中发光效率最高的体系， 发出黄绿光的 量子产率高达 0.88Einsteinmol10。 生物发光的高灵敏度和高选择性决定了它在分 -1- 析复杂体系中低含量组分时具有优越性，在生物医学、临床化学等方面有巨大的 应用前景。近年来生物发光技

5、术发展迅速，新的生物发光分析方法和应用报道很 多。但相比而言，生物发光分析目前在实际检测工作中还没有普及，主要是生物 酶难以获得，价格昂贵。目前，这种情况正在得到改变。Photinus Pyralis荧光素 酶和其它一些生物酶已能通过基因工程方法获得， 一些荧光素也有人工合成的方 法。这些成就将使生物发光得到更广泛的应用。 5 二、生命科学领域中的应用：二、生命科学领域中的应用： 1、微生物学领域中的应用：、微生物学领域中的应用： ATP-虫萤光素酶发光体系用于分析从微生物中提取的ATP，利用这一发光体 系测定微生物释放出的ATP，可进行微生物含量的测定，为在数分钟内检测微生 物提供了一种简便

6、而灵敏的方法11，这在卫生学和营养学上具有重要意义。 近几年来，这一技术在发达国家已越来越多地用于微生物快速检测12 14.。 国内在这方面的研究报导较少， 更没有广泛地实际应用15。 其主要原因在于对这 一技术的具体方法缺乏研究，在应用中用了不恰当的淬取剂和不合适的微生物 ATP淬取方法16，致使测量结果不理想，从而放弃使用这一技术进行微生物快速 检测分析。在对ATP技术中非微生物ATP的清除以及微生物ATP淬取方法进行了 实验观察后，结果表明：利用生物发光ATP技术快速检测微生物时，必须对非微 生物ATP进行有选择地淬取和水解，同时必须选择合适的微生物ATP淬取剂和淬 取方法。否则可能得出

7、错误的结果。 17 发光细菌的分类鉴定，按常规方法进行是繁琐的 18。而其发光光谱作为分 类的重要特征， 目前仅能够将它们区分至不同的属， 而对种的认定则无能为力19。 考虑到如何从光谱上作初步的分辨，采用检测其一阶和二阶微分光谱，对发光菌 的徽分光谱的特点作了分析。 20 由于不同种的发光细菌其生物发光光谱均为单一峰形曲线，缺乏精细结构， 彼此差异较小，而经过微分处理之后，各种发光细菌在光谱上的差异就充分显现 出来。依赖生物发光光谱及其微分光谱，不仅在发光菌属的认定上有帮助，还可 以区分不同的种。这在细菌分类中更是一种简便有效的方法，至少在初步认定发 光细菌的归属地位上，是具有较大意义的分类

8、特征。 2、细胞学检测中的应用、细胞学检测中的应用 由于ATP是维持细胞存活的基本物质，因此利用ATP启动的虫荧光素酶BL测 定样品中的活细胞数，或者检测细胞的增殖是BL在生物学中的应用领域之一。 近年来， 在该领域内的应用研究又有一些进展。 例如用于测定T细胞免疫活性 21 等。另外，还有人将该技术用于尿样中的细菌总数快速测定，与培养法比较,阳 性预测值可达 98%以上；临床随访数据也证明其与尿路感染有很好的相关性(灵 敏度：100%,特异性：80%,阳性预测值 45%，阴性预测值：100可作为一个临 床上对于尿路感染的早期筛选指标之一 22 。 RLPrice等将上述方法作了一些修改， 利

9、用细菌崩解时释放的腺苷激酶将ADP转化为ATP，从而利用BL测定细菌的降 解，以建立可在一小时内完成的快速药敏实验方法 23。 例如用于测定T细胞免疫活性 21等。另外，还有人将该技术用于尿样中的 细菌总数快速测定，与培养法比较,阳性预测值可达 98%以上；临床随访数据也 证明其与尿路感染有很好的相关性(灵敏度： 100%,特异性： 80%,阳性预测值 45%， 阴性预测值：100可作为一个临床上对于尿路感染的早期筛选指标之一 22 24 -2- 3、分子生物学领域中的应用、分子生物学领域中的应用: 近年来，新型化学发光试剂的研究取得了进展，利用化学发光进行标记和检 测核酸及其它生物分子的应用

10、愈来愈多，加上高灵敏度的生物发光、电致化学发 光标记技术的迅速发展， 使得许多非放射性标记检测的灵敏度达到甚至超过了同 位素标记测定。目前，这些新的发光标记手段正逐步普及，商品化的试剂和仪器 也在增多，未来的发展趋势将是化学发光、生物发光技术在核酸探针标记中占主 导地位。本文就近年来发展迅速的化学发光、生物发光、电致化学发光中最主要 的发光体系的原理、标记检测方法、特点、最新的进展及在核酸测定领域的应用 作一综述。 并对近年来出现的一些新的发光标记方法及未来的研究方法进行总结 和分析。 3.1 测量 ATP 的含量 ATP广泛存在于生物细胞内，是细胞代谢可利用能量的携带者，在ATP的水 解反应

11、中高能磷酸键就会变成腺苷二磷酸(ADP)，同时放出能量提供给生物代谢 用，因此，ATP称为生物细胞的动力。现有多种物化和酶偶联方法可用于测定 ATP1，其中较为理想的方法是利用虫荧光素酶催化的反应体系。 生物发光分析是利用生物体系在酶催化中所产生的发光来测定反应物质浓 度的一种灵敏方法。虫荧光素酶对底物ATP的专一性极强，通过发光光度计的光 电倍增管可灵敏地检测产物之一光子，所以，可准确地检测极微量的ATP。该 法在生物学、医学和农业等领域有着广泛的应用前景。通过溴化氰法将虫荧光素 酶固定化，并以固定化虫荧光素酶为核心构建流动柱式生物发光反应器。将该反 应器初步用于大鼠血液中ATP含量的测定。

12、用生物发光法测定下大鼠全血、肾上 腺的ATP含量已有报道，除血液外，还可以进行中ATP含量的生物发光测定。25 3.2. 发光标记及其在核酸领域中的应用 另一个重要的应用是用荧光素酶基因作为细胞中基因定量表达程度的报告 基因，荧光素酶基因作为标记物，经转录表达成荧光素酶后加入荧光素进行发光 检测， 可得知细胞中基因的转录活性26。 荧光素酶基因也可作为核酸探针标记物 用于核酸的杂交分析27.28。 各种荧光素的衍生物和荧光素酶构成的体系可在酶免 疫检测中得到应用。荧光素的衍生物，如酚羟基功能化的荧光素衍生物硫酸酯荧 光素、磷酸酯荧光素、半乳糖荧光素，本身虽不是荧光素酶的底物，但可分别作 为其相

13、应酶的底物，在相应酶的裂解下释放出的荧光素与荧光素酶作用而发光。 利用荧光素衍生物底物来进行酶免疫检测有很高的灵敏度，例如对于碱性磷酸 酶，磷酸酯荧光素作底物比对硝基苯酚磷酸发色底物的灵敏度高 60 倍29。另一 类 生 物 发 光 体 系 是 1962 年 从 水 母 Aequoreavictora 中 提 取 的 发 光 蛋 白 (aequorin)30，水母发光蛋白近年来引起人们特别的兴趣。这种发光蛋白(结构式 见图 5)不需要加入荧光素酶，只需加入Ca2+或Sr2+便能通过分子内反应触发出 =470的蓝光。 发光蛋白的发光机制被认为可能是Ca2+键合发光蛋白后诱导了 分子中发光部分(过

14、氧化的coelententerazine)分解。发光蛋白可被生物素化后作生 物发光标记物，灵敏度高于ELISA检测甚至AP AMPPD化学发光体系。在DNA、 蛋白质诊断、血浆糖蛋白质测定中已得到应用。5 令人惊喜的是，瑞典学者 Ronaghi 和 Nordstron 等最近发明一套利用 BL 进 行快速核酸序列分析的装置。其原理如下：利用一套计算机控制的蠕动泵及其阀 门构成连续进样系统， 并在 DNA 聚合反应体系中加入腺苷三磷酸双磷酸酶、 ATP 硫酸化酶(Sulfurylase)及荧光素酶。当聚合反应中产生的焦磷酸被 ATP 硫酸化酶 转化为 ATP 时，通过荧光素酶产生 BL 信号，该

15、信号被发光仪记录；而未参与反 -3- 应的脱氧核苷酸三磷酸(d NTP)被腺苷三磷酸双磷酸酶消化。这样,只要不断通过 进样系统将四种脱氧核苷酸三磷酸分别注入反应体系，并同时检测发光信号，就 可实现模板 DNA 序列的快速判读。 3.3 .基因突变的检测 基因突变是许多重大疾病(如肿瘤、糖尿病等)发生、发展的主要原因,检测与 疾病发生有关的突变基因,可达到早期诊断和及时预防的目的。随着人类基因组 计划(HGP)的完成，特别是人们对基因突变与人类健康和疾病关系的理解，在体 检和临床检验中，将突变基因的检测作为常规检测项目已越来越迫切。为此围绕 高效基因突变检测技术的开发，展开了一场激烈的竞争，发展

16、了许多方法，除早 期的限制性片段长度多态性分析(RFLP)和单链构象多态性分析(SSCP)法外， 最近 主要发展了微陈列法(基因芯片)、激光解吸质谱法、编码微球法、电场控制核酸 杂交法、 分子信标探针法(molecular beacons probes)和动态等位基因杂交法(DASH) 等。但这些方法各有优缺点，主要表现在:仪器昂贵,不能普及使用;测定条件要求 严格，操作烦琐,效率低、时间长，不适合常规临床使用。因此发展一种简便准 确的方法很有必要，最近Nyren等33 35采用生物发光分析法测定DNA片段序列, 是目前已知基因突变和单碱基多型性检测方法中准确度最高的方法之一， 并被命 名为焦测序法(pyrosequencing)。但该法在实际应用中需要特殊的设备，循环递加 1L以下的脱氧核糖核酸(dNTP)供测序反应