【2017年整理】血球计数板使用

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1、血球计数板血球计数板被用以对人体内红、白血球进行显微计数之用，也常用于计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量，是一种常见的生物学工具血 球 计 数 板含 义血 球 计 数 板 （ 改 良 牛 鲍 计 数 板 ） 用 优 质 厚 玻 璃 制 成 。 每 块 计 数 板 由 H 形 凹 槽 分 为 2 个 同 样 的 计 数 池 。 计数 池 两 侧 各 有 一 支 持 柱 ， 将 特 制 的 专 用 盖 玻 片 覆 盖 其 上 ， 形 成 高 0.10mm 的 计 数 池 。 计 数 池 画 有长 、 宽 各 3.0mm 的 方 格 ， 分 为 9 个 大 方 格 ， 每 个 大 格 面 积 为

2、 1.0mm.容 积 为0.1mm（ ul） ， 其 中 ， 中 央 大 方 格 用 双 线 分 成 25 个 中 方 格 ， 位 于 正 中 及 四血 球 计 数 板角 5 个 中 方 格 是 红 细 胞 计 数 区 域 ， 用 单 线 划 分 为 16 个 小 方 格 。 四 角 的 4 个 大 方 格 是 白 细 胞 计 数 区 域 ， 用 单 线 划 分 为 16 个 中 方 格 。 根椐 国 际 标 准 局 （ NBS） 规 定 ， 大 方 格 每 边 长 度 允 许 误 差 为 1%。 基 本 构 造血 球 计 数 板 血 球 计 数 板 是 一 块 特 制 的 厚 型 载 玻 片

3、 ， 载 玻 片 上 有 四 个 槽 构 成 三 个 平 台 。中 间 的 平 台 较 宽 ， 其 中 间 又 被 一 短 横 槽 分 隔 成 两 半 ， 每 个 半 边 上 面 各 刻 有 一小 方 格 网 ， 每 个 方 格 网 共 分 九 个 大 格 ， 中 央 的 一 大 格 作 为 计 数 用 ， 称 为 计 数区 。 计 数 区 的 刻 度 有 两 种 ： 一 种 是 计 数 区 分 为 16 个 大 方 格 （ 大 方 格 用 三 线隔 开 ） ， 而 每 个 大 方 格 又 分 成 25 个 小 方 格 ； 另 一 种 是 一 个 计 数 区 分 成 25个 大 方 格 （ 大

4、 方 格 之 间 用 双 线 分 开 ） ， 而 每 个 大 方 格 又 分 成 16 个 小 方 格 。但 是 不 管 计 数 区 是 哪 一 种 构 造 ， 它 们 都 有 一 个 共 同 特 点 ， 即 计 数 区 都 由 400个 小 方 格 组 成 。 计 数 区 边 长 为 1mm， 则 计 数 区 的 面 积 为 lmm2， 每 个 小 方 格的 面 积 为 1/400mm2。 盖 上 盖 玻 片 后 ， 计 数 区 的 高 度 为 0.1mm， 所 以 每 个 计 数区 的 体 积 为 0.1mm3， 每 个 小 方 格 的 体 积 为 1/4000mm3。 使 用 血 球 计

5、 数 板 计 数 时 ， 先 要 测 定 每 个 小 方 格 中 微 生 物 的 数 量 ， 再 换 算成 每 毫 升 菌 液 （ 或 每 克 样 品 ） 中 微 生 物 细 胞 的 数 量 。 使 用 方 法血 球 计 数 板 血 球 计 数 板1 视 待 测 菌 悬 液 浓 度 ， 加 无 菌 水 适 当 稀 释 （ 斜 面 一 般 稀 释 100 倍 ） ，以 每 小 格 的 菌 数 可 数 为 度 。 2 取 洁 净 的 血 球 计 数 板 一 块 ， 在 计 数 区 上 盖 上 一 块 盖 玻 片 。 3 将 菌 悬 液 摇 匀 ， 用 滴 管 吸 取 少 许 ， 从 计 数 板 中

6、 间 平 台 两 侧 的 沟 槽 内沿 盖 玻 片 的 下 边 缘 摘 入 一 小 滴 （ 不 宜 过 多 ） ， 让 菌 悬 液 利 用 液 体 的 表 面 张 力充 满 计 数 区 ， 勿 使 气 泡 产 生 ， 并 用 吸 水 纸 吸 去 沟 槽 中 流 出 的 多 余 菌 悬 液 。 也可 以 将 菌 悬 液 直 接 滴 加 在 计 数 区 上 （ 不 要 使 计 数 区 两 边 平 台 沾 上 菌 悬 液 ， 以免 加 盖 盖 玻 片 后 ， 造 成 计 数 区 深 度 的 升 高 ） ， 然 后 加 盖 盖 玻 片 （ 勿 使 产 生 气泡 ） 。 4 静 置 片 刻 ， 使 细

7、胞 沉 降 到 计 数 板 上 ， 不 再 随 液 体 漂 移 。 将 血 球 计 数 板放 置 于 显 微 镜 的 载 物 台 上 夹 稳 ， 先 在 低 倍 镜 下 找 到 计 数 区 后 ， 再 转 换 高 倍 镜观 察 并 计 数 。 由 于 生 活 细 胞 的 折 光 率 和 水 的 折 光 率 相 近 ， 观 察 时 应 减 弱 光 照的 强 度 。 血 球 计 数 板5 计 数 时 若 计 数 区 是 由 16 个 大 方 格 组 成 ， 按 对 角 线 方 位 ， 数 左 上 、 左下 、 右 上 、 右 下 的 4 个 大 方 格 （ 即 100 小 格 ） 的 菌 数 。

8、如 果 是 25 个 大 方 格组 成 的 计 数 区 ， 除 数 上 述 四 个 大 方 格 外 ， 还 需 数 中 央 1 个 大 方 格 的 血 球 计 数板 菌 数 （ 即 80 个 小 格 ） 。 为 了 保 证 计 数 的 准 确 性 ， 避 免 重 复 计 数 和 漏 记 ， 在计 数 时 ， 对 沉 降 在 格 线 上 的 细 胞 的 统 计 应 有 统 一 的 规 定 。 如 菌 体 位 于 大 方 格的 双 线 上 ， 计 数 时 则 数 上 线 不 数 下 线 ， 数 左 线 不 数 右 线 ， 以 减 少 误 差 。 即 位于 本 格 上 线 和 左 线 上 的 细 胞

9、 计 入 本 格 ， 本 格 的 下 线 和 右 线 上 的 细 胞 按 规 定 计入 相 应 的 格 中 。 见 右 图 ： 即 本 格 中 计 数 细 胞 为 3 个 。6 对 于 出 芽 的 酵 母 菌 ， 芽 体 达 到 母 细 胞 大 小 一 半 时 ， 即 可 作 为 两 个 菌 体计 算 。 每 个 样 品 重 复 计 数 2-3 次 （ 每 次 数 值 不 应 相 差 过 大 ， 否 则 应 重 新 操 作 ）， 按 公 式 计 算 出 每 mL（ g） 菌 悬 液 所 含 细 胞 数 量 。 7 测 数 完 毕 ， 取 下 盖 玻 片 ， 用 水 将 血 球 计 数 板 冲

10、洗 干 净 ， 切 勿 用 硬 物 洗刷 或 抹 擦 ， 以 免 损 坏 网 格 刻 度 。 洗 净 后 自 行 晾 干 或 用 吹 风 机 吹 干 ， 放 入 盒 内保 存 。 红 细 胞 计 数 公 式红 细 胞 数 /L=N*25/5*10*106*200 N 为 ： 五 个 中 方 格 的 RBC 总 数 N*25/5 为 ： 中 央 大 方 格 RBC 总 数 （ 即 ： 0.1mm（ ul） 的 RBC 总 数 ） N*25/5*10 为 ： 1mm（ ul） RBC 总 数 N*25/5*10*106 为 ： 1L 的 RBC 总 数 *200 为 血 液 的 稀 释 倍 数 公

11、 式 简 化 后 ： 红 细 胞 数 /L=N/100*1012 测 微 尺 的 构 造 和 使 用 方 法测 微 尺 分 目 镜 测 微 尺 和 物 镜 测 微 尺 .目 镜 测 微 尺 用 来 测 量 视 野 中 的 物 体长 度 ;物 镜 测 微 尺 是 标 准 长 度 ,用 来 标 定 目 镜 测 微 尺 . (1)目 镜 测 微 尺 的 构 造 目 镜 测 微 尺 是 一 块 圆 形 玻 片 ,其 中 央 刻 有 精 确 的刻 度 ,通 常 是 将 5mm 划 分 为 50 格 ,实 际 每 格 等 于 100 m.刻 度 的 大 小 随 着 使用 的 目 镜 和 物 镜 的 放 大

12、 倍 数 而 改 变 ,用 前 必 须 用 物 镜 测 微 尺 来 标 定 . (2)物 镜 测 微 尺 的 构 造 物 镜 测 微 尺 为 一 块 特 制 的 载 玻 片 ,其 中 央 有 一 小圆 圈 .圆 圈 内 刻 有 分 度 ,将 长 1mm 的 直 线 等 分 为 100 小 格 ,每 小 格 等 于 10 m. 目 镜 测 微 尺 的 标 定(1)取 下 目 镜 ,旋 下 目 镜 上 的 透 镜 ,将 目 镜 测 微 尺 放 人 目 镜 的 中 隔 板 上 ,使有 刻 度 的 一 面 朝 下 ,再 旋 上 透 镜 ,并 装 入 镜 筒 内 . (2)将 物 镜 测 微 尺 置 于

13、 显 微 镜 的 载 物 台 上 ,使 有 刻 度 的 一 面 朝 上 ,同 观 察标 本 一 样 ,使 具 有 刻 度 的 小 圆 圈 位 于 视 野 中 央 . (3)先 用 低 倍 镜 观 察 ,对 准 焦 距 ,待 看 清 物 镜 测 微 尺 的 刻 度 后 ,转 动 目 镜 ,使 目 镜 测 微 尺 的 刻 度 与 物 镜 测 微 尺 的 刻 度 相 平 行 ,并 使 两 尺 的 左 边 第 一 条 线相 重 合 ,再 向 右 寻 找 两 尺 的 另 外 一 条 重 合 线 .(4)记 录 二 条 重 合 线 间 的 目 镜 测微 尺 的 格 数 和 物 镜 测 微 尺 的 格 数

14、. 计 算 方 式(1)目 镜 测 微 尺 每 格 长 度 =两 个 重 叠 刻 度 间 物 镜 测 微 尺 格 数 10/两 个 重叠 刻 度 间 目 镜 测 微 尺 格 数 (2)以 同 样 方 法 ,分 别 在 不 同 倍 率 的 物 镜 下 测 定 测 微 尺 上 每 格 的 实 际 长 度 . (3)如 此 测 定 后 的 目 镜 测 微 尺 的 尺 度 ,仅 适 用 于 测 定 时 所 用 的 显 微 镜 的 目镜 和 物 镜 的 放 大 倍 数 .若 更 换 物 镜 ,目 镜 的 放 大 倍 数 时 ,必 须 再 进 行 校 正 标 定 . 血 球 计 数 板 的 构 造 和 使

15、 用血 球 计 数 板 是 由 一 块 比 普 通 载 玻 片 厚 的 特 制 玻 片 制 成 的 .玻 片 中 有 四 条下 凹 的 槽 ,构 成 三 个 平 台 .中 间 的 平 台 较 宽 ,其 中 间 又 被 一 短 横 槽 隔 为 两 半 ,每 半 边 上 面 ,刻 有 一 个 方 格 网 .方 格 网 上 刻 有 9 个 大 方 格 ,其 中 只 有 中 间 的 一个 大 方 格 为 计 数 室 ,供 微 生 物 计 数 用 .这 一 大 方 格 的 长 和 宽 各 为 1mm,深 度 为0.1mm,其 体 积 为 0.1mm3. 计 数 室 通 常 有 两 种 规 格 .一 种

16、是 大 方 格 内 分 为 16 中 格 ,每 一 中 格 又 分 为25 小 格 ;另 一 种 是 大 方 格 内 分 为 25 中 格 ,每 一 中 格 又 分 为 16 小 格 .但 是 不 管计 数 室 是 哪 一 种 构 造 ;它 们 都 有 一 个 共 同 的 特 点 ,即 每 一 大 方 格 都 是 由1625=2516=400 个 小 方 格 组 成 ,见 图 . 血 球 计 数 板 的 使 用以 计 数 酵 母 菌 为 例 (1)用 血 球 计 数 板 计 数 酵 母 菌 悬 液 的 酵 母 菌 个 数 . (2)样 品 稀 释 的 目 的 是 便 于 酵 母 菌 悬 液 的 计 数 ,以 每 小 方 格 内 含 有 4-5 个酵 母 细 胞 为 宜 ,一 般 稀 释 10 倍 即 可 . (3)将 血 球 计 数 板 用 擦 镜 纸 擦 净 ,在 中 央 的 计 数 室 上 加 盖 专 用