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1、Basic UV-Vis Theory and Applications,分光光度计的原理与应用,一、基本原理,利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此我们重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。,电磁辐射的波长,电磁波波长的范围,Region Wavelength (nm) Far ultraviolet 10
2、-200 Near ultraviolet 200-380 Visible 380-780 Near infrared 780-3000 Middle infrared 3000-30,000 Far infrared 3104-3105 Microwave 3105-1109,Relationship between light absorption and color,电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系,电子跃迁类型 例子 紫外吸收波长范围 * CH 100150 nm *(非共轭) CO 200 nm *(共轭) CC 200300 nm n* CO 300 nm,Examples
3、of transitions and resulting max,*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。,Commonly used solvents and their cut-off wavelengths,Solvent 溶剂 Cut-off (nm) Iso-octane 辛烷 202 Ethyl alcohol 乙醇 205 Cyclohexane 环己烷 200 Acetone 丙酮 325 Tetr
4、achloroethylene 四氯乙烯 290 Benzene 苯 280 Carbon tetrachloride 四氯化碳 265 Chloroform 氯仿 245 Ethyl ether 乙醚 220 Isopropyl alcohol 异丙醇 210 Methyl alcohol 甲醇 210,不同溶剂对酚紫外检测的影响,若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A”或“T”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。,吸收峰的命名,曲线上“A”处称最大吸
5、收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以max表示。 曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以min 表示。 曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。 在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。,max是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，max、min、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶
6、剂、浓度等。,由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱有许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。 由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。,紫外光谱中常用的术语,发色团、助色团、增色效应和减色效应。 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n*、*、 n* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：CC、CO等。
7、助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。,增色效应（hyperchromic effect）,核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。,减色效应（hypochromic effect）,在一定的条
8、件下，变性的核酸又可以复性，此时值又明显减少，回复到原来的核酸分子值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。,光吸收定律,朗伯比尔（Lambertbeer）光吸收定律： A-lgTb c A吸光度，又称光密度“O.D”。 T透光度， TI / I。， I。为照射到吸收池上的光强，I为透过吸收池的光强。 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）。 b样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，b=1cm。 C样品浓度（mol/L）。 吸光度A与物质的吸光系数“”和物质的浓度“C”成
9、正比。,检测计算溶液的摩尔浓度,例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2103 M-1cm-1（Mmol / L)。 A bC A（溶剂加样品的吸光度）（溶剂的吸光度） A0.6500.0700.580 b1cm C=7.110-5 mol / L,二、分光光度计的组成和构造,组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成： 光源：钨灯和氘(dao)灯 单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）； 样品室； 接收检测放大系
10、统； 显示或记录器。, 光源,理想光源的条件是：能提供连续的辐射；光强度足够大；在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；光谱范围宽；使用寿命长，价格低。 用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是3201100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。 用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。,钨灯灯丝温度和波长的关系, 单色器,单色器是分光光度计的心脏部分，它
11、的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：入射狭缝限制杂散光进入。色散元件即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。准直镜把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。出射狭缝只让额定波长的光射出单色器 转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。 光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅（即通称的反射光栅或闪烁光栅）和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝
12、，得到锐线光谱。,狭缝、光谱频带宽度和分辨率,出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。,纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。
13、 由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。, 样品室,包括池架、吸收池（即比色杯）以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05。 吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸
14、收池，使用波长范围是180nm3000nm。,吸收池使用注意事项,要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可用绸布丝线或软塑料制作小刷子清洗。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸
15、光度A为： A= A1A0, 检测器,检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。 光电二极管：原理是硅二极管受紫外近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强成正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。尤其值得注意的是由于计算机技术的飞速发展，使用光电二极管的二极管阵列分光光度计有了很大发展，二极管数目已达1024个，明显提高了分辨率。 这种新型分光光度计的特点是“后分光”，即氘灯发射的光经透镜聚焦后穿过样品吸收池，经全息光栅色散后被二极管阵列的各个二极管接收，信号由计算机进行处理和存储，因而扫描速度极快，约10ms就可完成全波段扫描，绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以最方便快速地得到任一波长的吸收数据，它最适宜用于动力学测定，也是高效液相色谱仪最理想的检测器。,显示输出装置,低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。现代高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机。 有的还带有标准软驱，存取数据更加方便（例如SPECORD 200）。,分光光度计光路原理图,光源切换镜,石英卤素灯,氘灯,滤色盘,场镜,入口,球面反
