《生物技术复习资料(完整整理版)汇总》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术复习资料(完整整理版)汇总（18页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、生物技术复习资料第一章 基因工程一专业符号Tetr 四环素抗性 R/M体系Ampr 氨苄青霉素抗性 pBR322 质粒载体M13 单链噬菌体载体 cosmid 科斯质粒IPTG 异丙基-D硫代半乳糖苷 DNA ligase DNA连接酶EcoRI 一种限制酶 host 宿主Plasmid 质粒 Ori 复制起始位点vector 载体 cDNA 互补DNAsouthern blot DNA印迹转移技术 MCS 多克隆位点二名词解释生物工程bioengineering利用生物有机体（包括微生物和动、植物）或其组成部分（包括器官、组织、细胞、细胞器）和组织成分（包括DNA、RNA、蛋白质、酶、多糖、
2、抗体等），形成新的技术手段来发展新产品和新工艺的一种技术体系。也是采用先进生物学和工程学技术，有目的、有计划定向加工制造生物产品的一个新兴技术领域。免疫分析法免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法。基因工程指按照人们的意愿，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之转入到原先没有这类分子的宿主细胞内，形成能持续稳定繁殖的新物种。其目的是为人类提供有用产品及服务。感受态细胞能从其周围摄入DNA的细胞称为感受态细胞。同聚物加尾法利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到D
3、NA分子单链延伸末端的3-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般1040个残基。可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。原位杂交技术根据核酸杂交原理，利用基因探针检出培养板上重组 转化体菌落位置的技术称之为原位杂交技术。DNA接头它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 标记营救SV40 DNA为载体的取代克隆方式又分为早期基因区域取代及晚期基因区域取代两种类型。晚期基因区域取代方式是以外源性DNA片段取代晚期基因区域，构成的重组DNA在宿主中可以复制，但不能产生重组病毒颗粒，因而采用早期基因缺失的SV40
4、病毒突变种作为辅助病毒与晚期取代重组DNA或和感染宿主，则晚期区域取代重组DNA可获得标记营救，辅助病毒产生的晚期基因产物与重组病毒的早期基因产物一起可形成完整病毒颗粒。早期区域取代方式是以外源性DNA片段取代早期基因区域，但重组DNA形成病毒颗粒与早期区域基因产物T抗原供应有关，故同样可采用晚期基因区域缺失的SV40突变种作为辅助病毒进行标记营救，即可形成完整病毒颗粒。R/M体系大多数的细菌对于噬菌体的感染都存在一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制(restriction)和修饰(modification)现象，简称R/M体系。衔接物指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或
5、数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。同尾酶虽来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端的限制性内切酶，称为同尾酶。 基因文库是将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。启动子启动子是位于结构基因5端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。转化Transformation自然的转化是指将携带某种遗传信息的DNA分子引入宿主细胞，通过同源重组作用获得具有新遗传性状的生物细胞的过程，基因工程操作中的转化是泛指将重组DNA转入宿
6、主中的方法。多克隆位点DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶的单一识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。回文结构双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，也称回文结构。同裂酶识别顺序与切割方式均相同的限制性内切酶。安慰诱导物能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，如，IPTG是一种乳糖类似物，再无乳糖的条件下，他可以诱导细胞合成半乳糖苷酶。因此，IPTG被称为半乳糖苷酶的安慰诱导物。衔接物连接法（linker）将衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，
7、接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。DNA接头法（adaptor）当DNA接头的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组的方法。插入灭活效应在基因工程早期使的某些载体(如pBR322)，这些载体本身有两个或更多个抗生素抗性基因和分布适宜的酶，即位点。用适当的酶处理DNA及载体，进行重组，即将外源DNA插入到某一抗性基因中，而使该基因失去抵抗某抗生素的表型。DNA-蛋白质筛选法是用来专门检测同DNA特异结合的蛋白质因子的一种方法。这种方法能用于筛选并分离表达融合的克隆。合成这种融合蛋白
8、的重组DNA分子中的外源DNA编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质（DNA binding protein）。蛋白质工程是指通过蛋白质化学、晶体学和动力学的研究，获取关于蛋白质物理、化学等各方面的信息，在此基础上，对编码该蛋白质的基因进行有目的的改造，并通过基因工程等手段将其进行表达和分离纯化，最终得到比天然蛋白质更好的产物。三填空题基因工程载体的必备条件：1、具有有效运载能力2、携带外源性目的基因前后在宿主内功能自主复制3、在宿主内能控制外源基因表达活动4、鉴定方便，装卸手续简单5、能携带大小不同的外源性目的基因、载体分子量要小,运载能力要大6、容易控制、安全可靠、稳定性
9、好常用的将重组DNA转入宿主细胞的方法：细菌转化与转染、高压电穿孔法、聚乙二醇介导的原生质体转化、磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、脂质体法、细胞核的显微注射法、激光打孔技术、基因枪法基因工程基本步骤：1、获得目的基因2、在体外获得形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的宿主细胞中，并与之一起增殖。4、从大量细胞繁殖群体中，筛选出获得重组DNA分子的宿主细胞克隆。5、从这些筛选出来的宿主细胞克隆中，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入宿主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。E.coli表达
10、系统中常用的强启动子：Lac、Trp、PL、PR 1）lac启动子2）trp 启动子3）tac启动子目的基因制备方法：一、基因分离的物理方法；二、鸟枪法(Shot gun) 又称霰弹法；三、cDNA文库的建立与基因的分离；四、基因组文库法；五、基因的化学合成；六、聚合酶链反应技术（PCR）外源基因在宿主细胞中高效表达的关键因素：一、有效的转录起始；二、mRNA的稳定性；三、有效地翻译启始；四、遗传密码应用的偏倚性；五、 mRNA的加工；六、 mRNA序列上终止密码的选择；七、表达质粒拷贝数及稳定性；八、外源蛋白的稳定性PCR主要步骤：1、高温变性：2、低温退火：3、适温延伸常用的克隆载体：细菌
11、质粒（Col E1质粒载体、pSC101质粒载体、pBR322、pUC质粒载体）、病毒DNA、噬菌体DNA噬菌体DNA和柯斯载体(cosmid)及单链DNA噬菌体载体(M13)DNA片段的连接方法：一、DNA连接酶和T4DNA连接酶；二、粘性末端DNA片段的连接（连接酶的作用）；三、平末端DNA片段的连接（同聚物加尾法、衔接物连接法、DNA接头连接法）真核病毒载体的优点：（常用的有SV40病毒载体及昆虫杆状病毒载体。）1、有很高的拷贝数；2、强大的启动子，可保证外源基因的高效表达；3、可保证糖基化。四问答题基因获得的方法有哪些？各有哪些特点？一、基因分离的物理方法：人们通过控制溶解温度使富A=
12、T区解链变性，而富GC区仍维持双链。当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富GC区的DNA片段 。二、鸟枪法(Shot gun)又称霰弹法：鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离，优点：操作简单，命中率较高。缺点：盲目性大，阳性片段不一定正好是基因，样本多，可能会漏。三、cDNA文库的建立与基因的分离：最关键的特征是它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列，局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA结构；细菌或原核生物的mRNA半衰期很短；mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难；仅限于克隆蛋白质编码基因,没有内含子，不能用于真核表达。四、基因
13、组文库法：从基因组文库所分离获得的基因序列包含有内含子，因此不能直接在原核细胞中表达，但更适合作为如转基因动物等的真核表达系统。五、基因的化学合成：优点1、可以合成细菌偏爱的密码子2、可以定向改变个别氨基酸3、可以在两端加上需要的限制酶切点4、可以通过自动化仪器合成。六、聚合酶链反应技术（PCR）优点：1、操作简单；2、通用性好；3、成功率高cDNA文库的建立有哪些步骤?1、分离表达目的基因的组织或细胞。2、从组织和细胞中制备总RNA和mRNA3、第一条cDNA链的合成4、第二条cDNA链的合成5、cDNA上接头的加入6、双链cDNA与载体的连接7、从众多的重组体中筛选出特定的基因限制酶命名原
14、则是什么?属名（大写）+种名（小写）+株名+分离序号外源基因在宿主细胞高效表达的关键问题及其解决方案一、有效的转录起始与基因的高效表达：选择强的可调控的启动子；二、mRNA的稳定性与基因高效表达：1、利用RNase缺失的受体菌，2、mRNA的5端与3端的正确加工，提高mRNA的稳定性；三、有效地翻译启始与基因的高效表达：1、首选AUG为起始密码子；2、正确的SD序列；3、 SD序列与起始密码子之间的距离以93为宜；4、除SD序列外，处于起始密码5端的核苷酸应为A和U；5、如果在起始密码AUG后的序列是GCAU或AAAA，能使翻译效率提高；6、在翻译起始区周围的序列应不形成明显的二级结构。四、遗传密码应用的偏倚性与基因高效表达：不同表达系统中，使用偏倚性密码，尤其对于基因编码序列的5端使用偏倚性密码，能有效提高表达效率。五、 mRNA的加工与基因高效表达：绝大多数较高等的真核基因含有内含子，这些内含子在mRNA的加工过程中，在细胞核中被加工去除而产生成熟的mRNA。但许多哺乳动物类细胞中外源基因的表达需要内含子存在，如果在转基因动物中表达外源基因时，最好用基因组基因而非cDNA。六、 mRNA序列上终止密码的选择：1、首选UAA；2、用一串连的终止密码，而不是只是一个终止密码，以保证翻译有效终止。七、表达质粒拷贝
