hplc-高效液相色谱[1]

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1、第四章 高效液相色谱法,一、色谱法概述,混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素， 色谱原型。 色谱法是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。,（动画）,1、 高效液相色谱法的特性,特点：高压、高效、高速、高灵敏 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 LCGC 互补性,液相色谱仪,2、色谱基本参数与流出曲线的表征,1.基线 无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。 2.保留值,（1）时间表示的保留值

2、保留时间(tR)：组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,（动画）,死时间(tM)：不与固定相作用的气体(如空气)的保留时间； 调整保留时间（tR ）：tR= tRtM,（2）用体积表示的保留值,保留体积（VR）： VR = tRqv qv为柱出口处的载气流量， 单位：m L / min。 死体积（VM）： VM = tM qv 调整保留体积(VR)： V R = VR VM,3. 相对保留值r21,组分2与组分1调整保留值之比： r21 = tR2 / tR1= VR2 / VR1,相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。,4.

3、区域宽度,衡量色谱峰宽度的参数，三种表示方法： （1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。 （2）半峰宽(Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354 。 （3）峰底宽(Wb)：Wb=4 。,2. 相平衡参数（1）分配系数（ partition coefficient） K,组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即：,分配系数是色谱分离的依据。,分配系数 K 的讨论,一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢； 试样一定时，K主要取决于

4、固定相性质； 每个组份在各种固定相上的分配系数K不同； 选择适宜的固定相可改善分离效果； 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础； 某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。,3.分配比 （partition radio）k,一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比。,1. 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。 2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。 3. 分配比可以由实验测得。,分配比也称：容量因子(capacity factor)和容量比(capacity radio)；

5、,4. 容量因子与分配系数的关系,式中为相比。 填充柱相比：635；毛细管柱的相比：501500。 容量因子越大，保留时间越长。 VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积； VS为固定相体积，对不同类型色谱柱， VS的含义不同； 气-液色谱柱： VS为固定液体积； 气-固色谱柱： VS为吸附剂表面容量。,5. 分配比与保留时间的关系,滞留因子（retardation factor）：,us：组分在分离柱内的线速率；u：流动相在分离柱内的线速度；滞留因子RS也可以用质量分数w表示：,若组分和流动相通过长度为L的分离柱，需要的时间分别为tR和tM，则,tR = tM(1+k),通过上式可直接

6、由实验获得的保留值求出分配比。,6. 分离因子,分离因子（也称为选择性因子）也可用来衡量两物质的分离程度，用表示。,7. 色谱流出曲线的数学描述,色谱峰为正态分布时，色谱流出曲线上的浓度与时间的关系为,当色谱峰为非正态分布时，可按正态分布函数加指数衰减函数构建关系式。,色谱理论需要解决的问题？,色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。,组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？ 组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制； （组分和固定液的结构和性质） 色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制； （两相中的运动阻力，扩

7、散） 两种色谱理论：塔板理论和速率理论。,塔板理论的假设： (1) 每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到； (2) 将载气看作成脉动（间歇）过程； (3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略； (4) 每次分配的分配系数相同。,3.2.2 塔板理论-柱分离效能指标,1.塔板理论（plate theory） 半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复。,（动画）,色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为,保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!,理论塔板数与色谱参数之间的关系为,n = L / H 色谱峰的方差 与柱

8、长或保留时间的关系为：,2.有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,3.塔板理论的特点和不足,(1)当L一定时，n 越大(H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。,(2)不同物质在同一色谱柱上的 K 不同，用n有效和H有效作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。,(3)柱效的高低不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。,(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效

9、不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,3.2.3 速率理论-影响柱效的因素,1. 速率方程（也称范弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：载气的线速率(cm/s)。,减小A、B、C三项可提高柱效。 存在着最佳流速。 A，B，C三项各与哪些因素有关？,A涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,B/u 分子扩散项,B = 2 Dg ：弯曲因子，填充柱色谱， 1。 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系

10、数（cm2s-1） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差; (3) B/u与流速有关，流速，滞留时间，扩散; (4) 扩散系数：Dg (M载气)-1/2 ， M载气，B值。,k为容量因子； Dg 、DL为扩散系数。 减小担体粒度，选择相对分子质量小的气体作载气，可降低传质阻力。,C u 传质阻力项,传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL，即 C =（Cg + CL）,（动画）,2.载气流速与柱效最佳流速,载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效。 载气流速低时： 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速,柱效 。,H -

11、u曲线与最佳流速： 由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。 以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。,3. 速率理论的要点,(1) 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散、传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。,(2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。,(3) 为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。,(4) 各种因素相互制约：载气流速增大，分子扩散项

12、的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。,影响分离的因素与提高柱效的途径 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略不计，即 H = A + C u,液体的黏度比气体大100倍，密度为气体的1000倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。,载体粒度较大时的LC曲线。,3.2.4 分离度,塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组分能够被完全分离。 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响

13、：保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素。 色谱分离中的四种情况如图所示：,讨论：,色谱分离中的四种情况：, 柱效较高，K(分配系数)较大，完全分离。 K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 柱效较低，K较大，但分离的不好。 K小，柱效低，分离效果更差。,分离度的表达式：,R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%； R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。,令Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻两峰的峰底宽近似相等），引入相对保留值和塔板数，可导出下式：,分离度基本关系式：,讨论：,（1）分离度与柱效 分离度与柱效 (n) 的平方根成正

14、比，r21一定，增加柱效，可提高分离度。但通过增加柱长来增加 n 使组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。 （2）分离度与r21 增大r21是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当r21增加一倍，需要的n有效 减小10 000倍。 增大r21的最有效方法是选择合适的固定液。,4.4.1 液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,基本原理：,流动相中的溶质分子（X）与

15、溶剂分子（S）在固定相吸附剂上的竞争吸附： Xm + nSa = Xa + nSm 下标m、a分别表示流动相和固定相，n是被吸附的溶剂分子数。达到吸附平衡时，吸附平衡常数（K）可表示为：,K分配系数，但K值大，表明该溶质分子在固定相上被吸附得多，吸附作用强，该组分的保留时间长，分配系数也大。吸附平衡常数K可以由吸附等温线数据求出。,等温吸附线与色谱峰形：,拖尾峰(凸形等温吸附线)： 被吸附分子首先占据强吸附力的点。低浓度时，主要被强吸附力的点吸附，保留时间长。,浓度高时，较多溶质分子被吸附力弱的点吸附，造成色谱峰中心部分运动速率较快，峰前移，而后沿部分吸附力相对较强，运动速率较慢，形成拖尾峰。

16、 液-固吸附分离模式适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,4.4.2 液-液分配色谱,固定相与流动相互不相溶。 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。 流动相：亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性(正相 normal phase)，反之流动相的极性大于固定液的极性(反相 reverse phase)。正相与反相的出峰顺序相反。 固定相：早期涂渍固定液，现已不采用。 化学键合固定相：将基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，如C18柱（反相柱）。,4.4.3 离子交换色谱,固定相：阴离子交换树脂或阳离子离子交换树脂。 流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶 。,基本原理,平衡时，平衡常数为,对于磺酸型阳离子交换树脂，一价阳离子的KB/A值顺序： Cs+Rb+ K+NH4+ Na+H+