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1、华 中 师 范 大 学 论文题目： DNA测序技术及其应用 年 级: 2014 学 号: 2014171527 姓 名: 黄慧贞 专 业: 生物学科教育 刘德利 生物技术实践专题DNA测序技术及其应用黄慧贞 2014172527 老师：刘德利 摘要:DNA测序技术是现代分子生物学研究中最常用的技术。从1977年第一代测序技术的出现,经过30多年的发展,DNA测序技术取得重大进展,以高通量为特点的第二代测序技术步成熟并商业化,以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经出现。本文简单介绍每一代测序技术的特点,并重点介绍了第二代测序技术及其应用。同时展望新的测序技术对于未来生物学研究及人们自身健康与人
2、类疾病等方面研究的影响。关键词：第一代DNA测序技术；第二代DNA测序技术；第三代DNA测序技术1.DNA测序技术的介绍生物的DNA碱基序列蕴藏着全部遗传信息。破解这些生命天书，对于阐明生命活动秘密无疑是至关重要的。对生物基因组进行完全测序是基因组学研究的重要方向，也是生命科学研究的核心领域。 1944 年，Avery 通过肺炎双球菌转化实验证明DNA 是遗传信息的载体1 . 此后，人们一直致力于DNA结构和序列研究, 使得 DNA 测序技术应运而生该技术对探索生命奥秘,治疗疾病,以及整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用。并具有广阔的应用前景。1.1第一代DNA测序技术较蛋白质与RN
3、A测序技术,DNA测序技术出现较晚.1977年，Sanger发明了双脱氧链终止法 (ddNTP) 的DNA测序技术2,同年Maxam 和Gilbert也报道了利用化学降解法进行DNA测序3. Sanger法测序的原理是在反应体系中加入一定比例的23一双脱氧核苷酸(ddNTP)，由于双脱氧核苷酸没有3-OH，且DNA聚合酶不能区分dNTP与ddNTP，所以当双脱氧核苷酸被聚合到链的末端，DNA链就停止延长。Sanger法操作简单，后来的DNA测序技术大部分都是在此基础上发展起来的。化学降解法的原理是，先对DNA末端进行放射性标记，再使用特殊的化学试剂进行降解，这些化学试剂均能对1个或者2个碱基发
4、生专一性断裂，最后通过聚丙烯酞胺凝胶电泳、放射性自显影技术读取待测的DNA片段。化学降解法程序复杂，后来逐渐被Sanger法代替。这2种方法都需要放射性同位素标记，操作繁琐，不能自动化，不能满足大规模测序的要求。 到了20世纪80年代末，研究人员逐渐利用荧光标记代替同位素标记测序，产物经过平板电泳分离，荧光分子在激光的激发下可以发射出不同波长的荧光，根据荧光信号可以确定DNA序列4。1985年，Smith等利用激光激发标记荧光，测序速度比常规力一法提高了数倍5。但是这种技术依然使用平板凝胶电泳，还是比较费时费力。到了20世纪90年代，毛细管电泳技术及微阵列毛细管电泳技术被应用于DNA测序6。这
5、一技术的出现提高了测序的通量，加快了人类基因组计划的完成7。但是毛细管阵列DNA测序在成本与耗时力一面远远满足不了基因组学发展的需要8，想获得突破必须寻找新的测序方法。1.2第二代测序技术近几年，DNA测序技术获得突破式发展。以高通量、低成本为主要特点的第二代测序技术己经广泛应用于基因组学的研究，并产生了重要影响。第二代测序技术也称为新一代测序技术,主要包括Solexa测序技术、454测序技术和SOLiD测序技术9。以下对3种技术分别作介绍。1.2.1 Solexa测序技术Solexa测序技术是目前性价比最高、应用最广泛的测序技术。Solexa测序的核心技术是DNA簇和可逆性末端终结 10，测
6、序原理是边合成边测序。测序的基本流程11-12:(1)构建测序文库。提取基因组DNA，随机打断成100200bp片段，末端加上接头；(2)桥式扩增。解链后的单链DNA片段两端被分别固定于芯片上，形成桥状结构，进行桥式PCR扩增。经过PCR扩增，产生数百万条待测的DNA片段，随后被线性化；(3)测序。将荧光标记的dNTP、聚合酶、引物加入到测序通道启动测序循环。DNA合成时，伴随着碱基的加入会有焦磷酸被释放，从而发出荧光，不同碱基用不同荧光标记，读取到核苷酸发出的荧光后，将3羟基末端切割，随后加入第2个核苷酸，重复第一个核苷酸的步骤，直到模板序列全部被合成双链DNA。1.2.2 454测序技术4
7、54测序技术突出优点是读长长，但是准确率低，成本高。测序具体步骤13：(1)构建测序文库。将基因组DNA打碎成300800个碱基的片段后，在两端加上锚定接头； (2)乳液PCR扩增。每个含有接头的DNA片段被固定在特定的磁珠上，进行乳液PCR扩增。多个循环后，磁珠表面被打破，扩增产生的成千上万个拷贝仍然在磁珠表面； (3)焦磷酸测序。将磁珠转移到PTP板上，每个PTP板上的小孔只能容下1个磁珠。分别装有T、A、C、G 4种碱基的试剂瓶，依次进入PTP板，每次只进1个碱基，如果发生配对，就会释放1个焦磷酸，释放出的荧光信号会被CCD捕获到。每个碱基反应都会捕获到1个荧光信号，由此一一对应，模板的
8、碱基序列由此获得。1.2.3 SOLiD测序技术SOLiD测序技术拥有第二代测序反应中最高的通量，其独特之处是其边合成边测序过程中以连接反应取代聚合反应。具体测序流程为14：(1)文库制备。将基因组DNA打断，在其两头加上接头，构建成文库；(2)乳液PCR磁珠富集。此过程与454测序技术类似，不过SOLiD的微珠只有1m；(3)微珠沉积(4)连接测序。混合的8碱基单链荧光探针为连接反应的底物，探针的5 7端用4色荧光标记，37端第1、2位碱基对应5 7端荧光信号的颜色。因为只有四色荧光，而2个碱基却又16个组合情况，故4种碱基对应一种颜色的荧光。单次测序由5轮测序反应组成，反应后得到的为原始颜
9、色序列(5)数据分析。测序错误经SOLiD序列分析软件自动校正，最后生成原始序列。2.3 第三代测序技术虽然第二代测序技术已经取得广泛应用，但是其必须基于PCR扩增，成本、准确性等关键问题仍然存在，科学家正在致力于新的测序解决方案。目前，以单分子测序为主要特征的第三代测序技术，也称为nextnextgeneration sequencing， 已经初现端倪。目前，比较看好的有 Heloscope单分子测序技术、 SMRT技术 以及 蛋白纳米孔测序技术15。2.3.1 Heloscope单分子测序技术Heloscope单分子测序技术也是基于边合成边测序的思想，但是不需要PCR扩增，所以更能反映样
10、本的真实情况，通量也更高。2.3.2 SMRT测序SMRT测序的核心是SMRT芯片，为一种多ZMW孔的厚度为100 nm的金属片，测序时将DNA聚合酶、不同荧光标记的dNTP、待测序列加入ZMW孔的底部，然后进行合成反应。荧光标记为磷酸基团，一个dNTP加入到合成链上和进入zMw孔同步进行，被激光束激发，依据荧光的种类判断dNTP的种类，后用氟聚物切割、释放，离开信号检测区 。2.3.3蛋白纳米孔测序技术蛋白纳米孔测序技术，利用d一溶血素制成的纳米孔，用核酸外切酶切割单链DNA，切下的单个碱基进入纳米孔，流过纳米孔的电流强度被瞬间影响，电流变化振幅代表每个碱基的特征。新的测序技术还不断被发明，
11、每项技术都有超过前代产品的特色。相信在不久的将来，测序技术的成本会进一步降低，用途也会更加广泛。3. 第二代测序技术的应用目前，第三代测序技术尚处于研发阶段，第二代测序技术已经应用于基因组学研究的各个方面，现将第二代测序技术在基因组测序及转录测序等方面的应用进行介绍。31 基因组从头测序及重测序从头测序主要应用于基因组序列未知的物种，DNA片段测序后，用生物信息学软件对序列进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。重测序是指该物种基因组序列已被测序，有参考基因组序列的测序工作。由于第2代测序技术测序读长较短，完成基因组的从头测序一般需要第一代测序技术的辅助，但是可以完成简单生物的基因组从
12、头测序及所有生物的基因组重测序。在第二代测序技术的推动下，大量生物的全基因组被顺利测序，大量物种的基因组计划完成183.2 RNA测序(RNAsequencing)mRNA是基因与蛋白质之间信息传递的桥梁，具有重要的调控作用。将全部mRNA提取出来，逆转录生成cDNA，用高通量技术进行测序的统称为RNA测序。测序有2种策略，一种将mRNA先反转录成cDNA再打断成片段后测序，另外一种将RNA片段化后再反转录。3.3其他方面的应用第二代测序技术用途非常广泛，除上面以外在宏基因组学研究、DNA一蛋白互作研究(ChIPSeq)、DNA甲基化研究等方面都有应用。宏基因组学是直接研究自然状态下微生物群落
13、的学科。低通量测序技术限制了研究样品的物种复杂度，而新一代测序技术能更好地满足宏基因组学研究的需要，并且扩大了宏基因组学的研究领域。4.前景和展望DNA测序技术经过30多年的发展,目前已经到了第三代,三代测序技术有各自的优势。第一代测序技术虽然成本高,速度慢,但是对于少量的序列来说,仍是最好的选择,所以在以后的一段时间内仍将存在;第二代测序技术刚刚商用不久,正在逐渐走向成熟;第三代测序技术有的刚刚出现,有的则正在研制,相信很快便可进行商业化运作。可以预见,在未来的几年里会出现三代测序技术共存的局面。随着新的测序技术的出现,大规模测序的成本迅速下降。届时,对于遗传病的诊治将变得简单、快速,并能从
14、基因组水平上指导个人的医疗和保健,从而进入个人化医疗的时代。同时,生物学研究的进展将会更多地依赖于测序技术的进步,不同领域的科学家花很少的钱就可以对自己熟悉的物种基因组进行测序,从而更好地指导试验设计,取得更多新发现。参考文献1Avery O T, MacLeod C M, McCarty M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal typesJ. J Exp Med, 1944,98:451-460.2SANGER F，NICKLEN S，COULSON
15、A RDNA sequencing with chainterminatinginhibitorsJProc Natl Acad SciUsA，1977，74(12)：546354673MAxAM AM，GILBERT w， A new method for sequencing DNAJPr。c Natl Acad sciusA，1977，74(2)：560-5644聂志扬，肖飞，郭健DNA测序技术与仪器的发展J，中国医疗器械信息，2009，15(10)：13165SLMITH L M，FuNG S，HuNKAPILLER M w，et a1The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at 5，terminusSynthesis of fIuorescent DNA primers for use in DNA sequence analysisJNucleic Acids Res，1985，13(7)：2399一Z4126
