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1、博闻强记，厚积薄发，向规范要分数，以扎实取成绩！选修三 专题1 基因工程讲义 张兴普 2016.02.06第一节 基因工程的原理一、 基因工程：指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物新的遗传性状，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行的设计和施工，因此又叫DNA重组技术。 理解定义掌握以下几点：1、 是一种按照人们的愿望，定向改变生物遗传特性的技术定向变异2、 分子水平的操作3、 原理：体外进行的人为的物种间的基因重组。4、 一旦成功，便可遗传可遗传变异5、 主要技术为体外DNA重组和转基因技术对基因工程的理性思
2、考：正面：提高农作物抗逆性改良农作物品质 负面：转基因生物的安全危机对生态环境的破坏二、 几种现代生物技术的比较基因工程DNA分子水平的操作：DNA重组、转基因、基因探针检测等蛋白质工程通过基因修饰或基因合成，改造天然蛋白质或创造自然界不存在的蛋白质细胞工程细胞或者细胞器水平的操作：细胞融合、细胞杂交、细胞拆合等胚胎工程针对动物早期胚胎和配子的操作：胚胎移植、体外受精等三、 基因工程的工具：工具酶(限制酶和DNA连接酶)和运载体1、 限制酶：“分子手术刀”“基因工程的剪刀”（1）、来源：主要从原核生物中分离纯化（2）、在原核细胞自身的作用：是一种防御性工具，可切断外来入侵的外源DNA，以确保自
3、身安全（3）、在基因工程中的作用：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列且使每一条 特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，从而切断DNA分子（4）、作用部位：（切断两个）磷酸二酯键（5）、识别的序列：大多数由6个核苷酸组成，少数由4、5、8个，从5读向3端（6）、识别的序列的特点：以中轴线呈中心对称（7）、切割结果： 从中轴线两侧切，形成黏性末端 例如：EcoR限制酶： -GAATTC- EcoR限制酶 -G AATTC- -CTTAAG- -CTTAA G- 从中轴线切，形成平末端 例如：Sma限制酶： -CCCGGG- Sma限制酶 -CCC GGG- -GGGCCC- -GGG CCC
4、- 2、DNA连接酶“针线”“缝合针” （1）、在基因工程中的作用：拼接切下来的DNA片段，恢复磷酸二酯键。 （2）、根据来源不同分类： E.coliDNA连接酶 连接 黏性末端T4DNA连接酶 连接 黏性末端和平末端（但连接平末端效率低） （3）、DNA连接酶和DNA聚合酶的比较 相同点：化学本质都是蛋白质，作用都是形成磷酸二酯键。不同点：DNA聚合酶在DNA复制时发挥催化作用，而DNA连接酶在连接DNA片段时发挥催化作用 DNA聚合酶是将单个的脱氧核苷酸加在正新合成的DNA子链的3末端游离的-OH末端，脱水缩合形成n-2个磷酸二酯键；DNA连接酶是在俩个片段DNA的两个缺口形成2个磷酸二酯
5、键。DNA聚合酶是以亲代DNA的每一条链为模板，DNA连接酶不需要模板。 图示：DNA聚合酶: DNA模板 3 5新合成的子链 5 引物 - OH 3+单体 合成方向DNA模板 5 3新合成的子链 单体+ 3HO- 引物5 合成方向DNA连接酶： 在两个缺口处形成2个磷酸二酯键 （4）、为何不同物种的DNA可以拼接？（DNA拼接成功的原因？） 不同物种的DNA分子结构（双螺旋结构）、化学组成相似。 都遵循碱基互补配对原则，且有互补序列 （5）、转基因生物能成功表达他物种（目的基因）的原因： 蛋白质分子组成，结构相似、合成方式相同 生物界共用一套密码子 （6）、注意：到目前为止，所发现的DNA连
6、接酶都没有连接单链DNA的本领。 （7）、注意:2个DNA片段的的2个缺口用DNA连接酶催化形成2个磷酸二酯键，黏性末端碱基之间的H键自动粘合。3、运载体“分子运输车” （1）、作为基因工程运载体的条件：至少有一个到多个限制酶的切割位点 能自主复制或整合到受体染色体DNA上随其同步复制 有标记基因鉴定并选择导入目的基因的受体细胞。 对受体细胞无害，能友好借居受体细胞。（如不能影响受体细胞的代谢） 运载体DNA大小要合适 （2）、基因工程的运载体：质粒（常用）:一种裸露的独立于拟核DNA之外能自我复制的小的环状DN噬菌体的衍生物 动、植物病毒 （3）、注意：真正被用作运载体的质粒是经过人工改造的
7、天然质粒。（否则不符合条件）生物材料cDNA一定大小范围的 DNA基因组文库mRNAcDNAcDNA文库PCRPCR已知碱基序列的目的基因人工合成第一步 获取目的基因 限制酶切割 反转录酶 第二步基因表达载体构建启动子（RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录出mRNA）目的基因（含控制人类需要性状的结构基因）标记基因（鉴定选择导入目的基因的受体细胞）终止子（使转录停止的位点）复制原点（复制开始的特定位点）基因表达载体第三步将目的基因导入受体细胞基因表 达载体植物体细胞（植物体细胞全能性）动物受精卵（全能性最高）大肠杆菌第四步 目的基因的检测和鉴定检测是否转录出mRNA检测是否插入了目的基因 检
8、测是否翻译出蛋白质分子水平的检测鉴定个体是否具有目的基因所控制的性状个体水平的鉴定 组成 核心步骤 改造天然质粒 缺啥拼接啥 农杆菌转化法导入 显微注射法导入 感受态细胞法 Ca2+离子处理 DNA分子杂交法 分子杂交法 抗原抗体杂交 （通过对照实验） 第二节基因工程的步骤一、 具体重点内容1、 目的基因的获取方法：（1）、从自然界已有生物中分离 （2）、人工合成 具体方法：（1）、从基因文库获取 （2）、利用PCR扩增目的基因 （3）、人工合成目的基因2、 基因文库：（1）、定义：将某物种的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体储存，各个受体菌分别含有该生物的不同基因 （区分：基因库:一
9、个种群的全部个体所含的全部基因叫该种群的基因库。） （2）、分类：基因组文库含某一物种的全部基因的基因文库 部分基因文库含某一物种的部分基因的基因文库。如cDNA文库 （3）、cDNA文库和基因组文库的比较：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小（部分基因文库）大（含全部基因）启动子无（转录形成的mRNA被剪切）有内含子无（转录形成的mRNA被剪切）有基因多少少，部分多，全部物种间的基因交流可以部分基因可以 3、基因表达载体的构建：基因过程的核心步骤。 （1）、基因表达载体构建的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给后代，同时使目的基因表达和发挥作用。绝不能将目的基因（或DNA）
10、直接导入受体细胞。 （2）、基因表达载体的组成： 启动子+目的基因+终止子+标记基因+复制原点 复制开始的特殊位点 鉴定和选择导入目的基因的受体 细胞（基因过程第三步） 使转录在需要的地方停止 是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录出mRNA （3）、受体细胞不同，基因表达载体的构建有所差异，不能全篇一律。 4、将目的基因导入受体细胞： （1）、转化：将目的基因导入受体细胞，维持稳定和表达的过程 （2）、将目的基因导入受体细胞，受体种类不同，导入的方法不同：不同的受体细胞导入的方法备注植物（一般用植物体细胞，植物体细胞的全能性）农杆菌转化法最常用，双子叶和裸子植物基因枪法适宜于单子叶植物花粉管通道法我国独创，十分简便经济的方法动物（用受精卵，全能性最高，不能用体细胞）显微注射法动物的体细胞的全能性受细胞质的限制。也可以用克隆动物过程中的重组细胞微生物感受态细胞法Ca2+离子处理，增大细胞通透性，易于吸收外源DNA状态（3）、基因过程利用微生物的原因：繁殖快 多为单细胞生物 遗传物质相对少（4）、目的基因是否导入受体细胞需要用标记基因鉴定和选择。5、目的基因的检测与鉴定 （1）、分子水平的检测：用基因探针检测转基因生物的体细胞中是否有目的基因
