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1、航天突变株黑曲霉ZM-8产纤维素酶条件研究05级生物科学： 刘小飞 指导老师： 马旭光摘 要:对航天突变株黑曲霉ZM-8在玉米秸秆为主要原料的固态培养基上发酵产纤维素酶的条件进行了研究。实验结果表明，黑曲霉ZM-8产纤维素酶的最优培养基配方为：氮源为(NH4)3PO4，含氮量0.6%，含水量300%，玉米秸杆粉与麸皮质量比为4:1，接种量为1:30。最佳培养条件为:培养温度35，培养时间为72h，初始pH值为6.5。在优化条件下测得FPU酶、C1酶、CX酶和-葡萄糖苷酶的活力分别为5.25U/mL、0.48U/mL、19.60U/mL和42.86U/mL，约为优化前各酶活的3.0倍、1.8倍、
2、2.5倍和2.1倍。关键词: 黑曲霉ZM-8；FPU；CX；发酵条件；优化1 文献综述纤维素（fiber）是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%1；全球每年通过光合作用产生的纤维质高达1.55109t，而对其利用率仅为11%2。目前，我国每年光作物秸杆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿t之多3，大多都采用燃烧或粗饲料方式的利用。这样即丧失了有机质成分，又容易造成环境污染。因此，提高纤维素的有效利用率具有巨大的发展潜力，而对其有效的利用途径之一就是利用微生物分泌的纤维素酶进行降解。该途径不仅能拓宽饲料来源
3、，提高饲料质量，而且在有利于生态平衡的条件下能缓解粮食短缺及环境污染等问题，可有望发展成为一种集生态效益、社会效益和经济效益一体的清洁产业。自然界中大量而广泛地存在着能降解纤维素的微生物，它们种类繁多，包括细菌、真菌和放线菌等。纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要有外切葡聚糖酶（C1酶）、内切葡聚糖酶（CX酶或CMC分解酶）和-葡萄糖苷酶，C1酶主要作用于天然纤维素，将其转变为水合非结晶纤维素，CX酶接着将水合非结晶纤维素水解成纤维素糊精和纤维二糖；-葡萄糖苷酶作用于纤维二糖生成葡萄糖4，这四种酶协同作用将天然纤维素降解为葡萄糖。目前研究最多的产纤维素酶的微生物大多数是真菌，其
4、中木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属及漆斑霉属占多数。木霉具有对植物病原真菌的拮抗作用和强烈分解纤维素的能力，广泛存在于土壤等基质中，但因其酶系中的-葡萄糖苷酶活力偏低和毒性嫌疑大而使应用受到限制。黑曲霉（Aspergillus niger），属半知菌类真菌，在自然界的分布极为广泛，有多种活性强大的酶系，不仅是公认的安全菌株，而且产纤维素酶能力较强，且所产的纤维素酶种类较全，其中-葡萄糖苷酶的活性在所有产纤维素酶的真菌中是最高的，是发酵饲料工业中不可或缺的最佳菌种之一，所产生酶制剂具有用量大，应用广泛，安全性好的特点。此外，它对培养基营养要求低，只要培养基中有碳源、氮源以及磷、钾、镁、硫等元素即能
5、良好生长。关于纤维素酶的研究国内外已有大量报道。刘颖对黑曲霉 9813X8株的选育及其固态发酵条件的优化进行了研究。结果表明，用稻草和麸皮作培养基既降低了成本，又有利于霉菌产生较高活性的纤维素酶；产纤维素酶的理想氮源是酵母浸膏，其次是豆饼和硫酸铵；该菌株固态产酶的优化条件是：稻草、麸皮与自来水比为1：1：4，氮源为1.0%的硫酸铵和1.0%的豆饼，培养基的起始pH值为3.23.5，培养时间为4860h，250ml三角瓶中装培养基510g 5。 郑毅等对黑曲霉(Aspergillus niger)产-葡聚糖酶固态发酵优化的研究表明，该菌株的最佳为：C/N (以麸皮与豆饼粉比例计)为8：1；最佳无
6、机氮源为NH4NO3；大麦对产酶没有明显的诱导作用，相反在培养基中添加过多的大麦粉，反而影响培养基中的C/N，使产酶水平下降；培养基最适水分比例为1：1；最适培养基初始pH为6.0；最适接种量为每瓶0.5mL孢子悬液(孢子浓度为415107/mL)；最适的培养温度为33。在以上最适条件下固态培养70h，最高酶活可达141649u/g，比初始设计提高了26% 6。贺小贤等对黑曲霉-葡聚糖酶产酶培养基的研究表明，黑曲霉（Aspergillus niger）产-葡聚糖酶的单一因素为：大麦粉为最佳碳源，酵母粉和硫酸铵为最适氮源，-葡聚糖、吐温80对-葡聚糖酶的产生有一定的促进作用；通过正交实验，确定了
7、大麦粉、酵母粉、硫酸铵三者之间的最优组合为大麦粉3%、酵母粉2%和硫酸铵0.2% 7。早期就有研究表明，真菌纤维素酶是一类胞外酶，从培养物滤液中就可以很容易得到。它又属于诱导酶，在诱导物存在下才能大量产生。纤维素酶的分泌又受分解代谢产物阻遏(catabolite repression)和反馈抑制(feedback inhibition)两种作用。许多不溶性的纤维素、可溶性的纤维衍生物、一些低聚糖类对某些单糖和二糖均可作为纤维素酶的诱导物。但需要一提的是，纤维二糖、葡萄糖和甘油等低分子可溶性糖在低浓度时有促进作用而较高浓度时便开始抑制。当然，对于不同微生物来说，同一浓度的同一物质也可能有着不同甚
8、至完全相反的作用，这方面的研究还甚少。在纤维素酶的生产条件中，pH值和发酵时间是关键。Mandles8等发现，在分批培养物发酵过程中，起初pH最好是自然下降到3.03.5，再加控制以防止pH降低，消耗纤维素以后自然上升，这样有利于酶的大量分泌。连续培养的情况不同，保持较低pH时，菌生长受到抑制，酶产量减少，而保持pH5.0时则可提高酶产量。纤维素酶的发酵过程中，有分泌高峰期，且高峰期的稳定性因培养基不同而有很大差异。本实验在已筛选出高产纤维素酶菌株黑曲霉ZM-8的基础上，对其产酶条件进行了优化，以期获得该菌株产酶的最适培养基和最适培养条件，进而为该菌株的大规模、工业化降解玉米秸秆提供有价值的工
9、艺参数。2 材料与方法2.1 菌株 航空诱变的黑曲霉（Aspergillus niger）菌株ZM-89，保存于PDA斜面培养基，由天水师范学院微生物实验室筛选。2.2 试剂及仪器2.2.1 主要试剂DNS试剂10、柠檬酸缓冲液、水杨素(Sigma)、羧甲基纤维素钠、新华定性滤纸，其它均为国产的化学纯或分析纯。2.2.2 发酵原料玉米秸秆粉( 当地农户提供，粉碎至一定粒度)、麸皮(市售)。2.2.3 主要仪器CS213电热恒温培养箱(重庆试验设备厂)；TGL-20M高速冷冻离心机(湘仪仪器厂)；722 型分光光度计(上海欣茂仪器有限公司)；XSP-18B双筒显微镜(江南医用光学仪器厂)；PHS
10、-2C型精密酸度计(上海精科雷磁)；DZKW-4型电子恒温水浴锅(黄骅市渤海电器厂)；THZ-82A台式恒温振荡器(上海跃进医疗器械厂)。2.3 培养基2.3.1种子培养基玉米秸秆粉100%，营养液250%（v/w），其成分为2.0% (NH4)2SO4、0.05% MgSO47 H2O和0.01% KH2PO4。pH 值自然。2.3.2 基础产酶培养基玉米秸秆粉60%，麸皮40%，营养液250%（v/w）其成分为2.0% (NH4)2SO4、0.05% MgSO47 H2O和0.01% KH2PO4。 pH 值自然。上述培养基均需在1.0105 Pa、121灭菌30min。2.4黑曲霉ZM-
11、8产纤维素酶的发酵方法2.4.1 种曲的制备 在装有种子培养基的三角瓶中接入1菌耳黑曲霉ZM-8试管斜面菌种，在30条件下恒温培养72h，待菌丝生长旺盛、孢子丛生时即可放入冰箱保存，供种曲备用。2.4.2 固体产酶培养 在250ml发酵罐中装入10g固体发酵培养基（以风干主料计），灭菌冷却后接入1菌耳种曲孢子于30下恒温培养72120h测定酶活。2.4.3 未优化产酶试验 在未优化的培养基成分和未优化的培养条件下测定各组分酶活为：滤纸酶活力(FPU)1.84 U/mL、C1酶活力0.27 U/mL、CX酶活力8.16 U/mL、-葡萄糖苷酶活力20.14 U/mL。未优化的培养基成分为：玉米秸
12、杆粉与麸皮按3：2比例混合，氮源为2.0%(NH4)2SO4，含水量为250%（v/w），接种量（固体曲与干基质的质量比）为1：10；未优化的培养条件为：初始pH值为6.0，培养温度为30，培养时间72h。2.4.4 测定指标FPU是表征纤维素酶系中组分酶之间的协同作用11，而Cx酶活代表外切-1，4葡聚糖酶活力和内切酶活力的总和，其大小可直接说明纤维素酶对纤维素的降解能力12。因此，在以下各试验中测定的酶活指标为FPU酶和Cx酶，每个处理均设3次重复。2.4.5 最佳氮源的确定 氮源是指能被微生物用于构成细胞物质和代谢产物中氮源来源的营养物，是微生物发酵的主要原料之一。本实验中分别以NH4C
13、l、NH4NO3 、(NH4)2CO3、(NH4)2SO4、(NH4)3PO4和尿素为发酵培养基中的氮源（含氮量均为1%），其他条件不变，测定酶活。2.4.6 培养基成分优化 在确定了最佳氮源的基础上，改变产酶培养中的含氮量、麸皮添加量、水料比以及接种比。为了确定这些因素用量的最佳配比，本试验采用了L(4)正交试验设计的方法对产酶培养基进行优化13，试验因素水平见表1。表1 产酶培养基正交实验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment of producing enzyme medium水 平 含氮量（A） 玉米秸秆粉/麸皮（B
14、） 水料比（C） 接种量（D）1 0.2% 2：3 150% 1：302 0.6% 3：2 200% 1：253 1.0% 4：1 250% 1：204 1.4% 5：0 300% 1：152.4.7产酶培养条件优化 采用L(34)正交试验对初始值pH、培养时间、培养温度 13进行优化，试验因素水平见表2。表2 培养条件正交试验因素和水平表Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment of cultivation condition水平 培养时间（A） pH（B） 培养温度（C）1 48h 5.5 252 60h 6.0 30 3 72h 6.5 35 4 84h 7.0 40 2.4.8 测定方法 2.4.8.1 粗酶液的制备 取生长良好的固体
