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1、灵芝品质近红外检测技术的研究进展 摘要：随着灵芝鉴定方法在灵芝质量控制中的不断应用和发展，近红外光谱技术在灵芝鉴定中逐渐显现优越性。本文系统归纳和总结了近红外光谱技术在灵芝多糖、三萜、蛋白质、产地分析及掺伪检测分析中的应用，为进一步开发和完善近红外光谱技术在灵芝鉴定中的应用奠定基础。关键词：灵芝；近红外光谱技术；多糖；三萜；1. 引言：灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体，是自然界分布广泛的一类真菌生物，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属，在我国有60多种，包括赤芝、黄芝、紫芝、黑芝、薄盖灵芝、树舌等世界上灵芝科的种类主要分布在亚洲、澳洲、非洲及美洲的热带及亚热带，少数分布于温带，而我国地跨热
2、带至寒温带，灵芝科种类多而分布广1。灵芝在我国有悠久的药用历史，被列为名贵中草药，它具有调节免疫系统、增强机体细胞免疫功能、增强淋巴细胞的DNA多聚酶活性、镇定、止痛、抗过敏、抗福射、抗病毒、抗肿瘤、保护心血管和呼吸消化系统等作用灵芝的这些药理活性与其中所含的有效化学成分密切相关，近年来国内外学者已从灵芝中分离出150余种化合物2。灵芝药材所含成分复杂，种类繁多，如三萜类、多糖类、蛋白类、多肽类、核苷类、甾醇类、挥发油、生物碱、甘露醇、多种酶类、呋喃衍生物、脂肪酸和微量元素等。研究发现，这些活性成分具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、降血糖、降血脂、抗病毒、消炎抗菌以及保肝护肝等功效，且几乎无毒副作
3、用，受到医药界的广泛重视3。因此，建立专属性强的定性、定量检测项目，如性状与形态、颜色与气味、水分、灰分、指纹图谱等，可以为其相关成药产品的质量保证提供科学依据，同时也需要不断地完善药品标准，才能保证灵芝药材的安全性与有效性。然而，由于灵芝药用功效和保健功能的持续更新，市场需求显著增加，但不可持续的采掘和生态环境的破坏，野生灵芝已基本绝迹。近年来，灵芝的人工培植实验已获成功，但起步晚，规模小，产量低的现状远未能满足如今市场的需求。另外，市场管理的混乱导致市售灵芝药材中常常以次充好，鱼目混珠，严重影响了灵芝的药效和中医药临床疗效及其安全性。因此，我们急需制定切实可行的灵芝药材质量标准，涵盖栽培、
4、形态、生理生化和分子生物学等多方面，并对灵芝属菌株进行全面系统的研究，继而建立一个全国性的数据库系统，为灵芝属的分类学、生物活性研究和灵芝产品幵发提供有效的理论依据。该文重点介绍基于近红外光谱检测技术检测灵芝几种主要活性成分及其生物活性的国内外研究现状，旨在进一步推动灵芝产业的快速发展，并为保健食品、药品的研究和生产提供科学依据。2. 近红外分析技术及研究进展2.1近红外检测技术近红外光是波长范围分布在7802526nm，换算成波数范围在395912820cm-1的一种电磁波按照波长范围可划分为短波近红外（SW-NIR），其波长范围在7801100nm和长波近红外（LW-NIR），其波长范围在
5、11002526nm4。在短波近红外波长范围内，近红外光谱检测方式主要采用透射方式，直接穿透所测样品，取得样品深层信息的近红外吸收光谱，常用于溶液与固体样品的检测；而在长波近红外波长范围内，近红外光谱检测方式主要采用入射光与反射光的光强关系来获得物质在近红外区的吸收光谱，常用于固体和半固体类样品的测量。近红外光谱所反映的主要信息来自于分子中原子间含氢基团（主要包括O-H、C-H、N-H、P-H等）的振动合频与各级倍频的吸收特性，信息涵盖极为丰富5。这些基团是有机物中结构和组成最重要的一些基团，在NIR谱区几乎可以找到所有有机物与之对应的特征吸收信号，且容易获取稳定的谱图。正是通过这些丰富的结构
6、与组成信息NIR分析技术才可以分析测定与这些基团有关的成分以及物理、化学性质，如物质的密度、黏度、颗粒的大小以及有关样品的电学、热学和力学性质等。近红外光谱不仅能够反映绝大多数有机化合物的组成和结构信息，而且对某些无近红外光谱吸收的物质(如某些无机离子化合物)，也能够通过对其共存的本体物质的影响而产生的光谱变化，间接地反映它们存在的信息。近红外光谱分析技术包括定性分析和定量分析，定性分析的目的是确定物质的组成与结构，而定量分析则是为了确定物质中某些组分的含量或物质的属性。与常规的化学分析方法不同，近红外光谱分析法是一种间接分析技术，是用统计学的方法在样品待测属性与近红外光谱数据之间建立一个校正
7、模型。因此在对未知样品进行分析之前需要搜集一批用于建立校正模型的校正样品，获得近红外用近红外光谱仪器测得的样品光谱数据和用化学分析方法测得的真实数据。通常采集的近红外光谱会包含一些与待测样品性质无关的因素带来的干扰，导致基线漂移、随机噪音及光谱的不重复6。合理的对光谱进行预处理可以提取有效的近红外光谱信息，消除各种非目标因素对光谱的影响，奠定模型建立和未知样品组成或性质预测的基础。因此对原始光谱进行预处理是非常必要的。常见的光谱预处理方法主要包括中心化、平滑、求导、多元散射校正、归一化等。其中中心化使得所有数据都分布在零点两侧，可充分反映信息的变化。平滑是常用的一种消除小方差，保留大方差的方法
8、。求导可消除基线偏移，克服谱带重叠。多元散射校正(MSC)可以消除漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪音，消除漫反射光谱的基线及光谱的不重复性。归一化可以消除光谱的变化或样品稀释浓度等变化对光谱产生的影响。采用不同预处理方法建立近红外光谱预测模型时，R2越大，RMSEC越小，模型的预测效果越好。近红外光谱分析技术具有对环境无污染、不破坏样品、成本低、无需前处理等许多优点，在提高灵芝品质检测分析水平、控制灵芝制品质量与成本、减少资源损失等方面具有巨大的优势和无可比拟的发展前途。2.2灵芝多糖的检测灵芝多糖是由肽多糖、葡萄糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物，含有少量D-阿拉伯糖、D-木糖、
9、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖等单糖。目前已分离到的灵芝多糖有200多种，是灵芝的最有效成分之一，其中大部分为-型的葡聚糖，少数为-型的葡聚糖。灵芝多糖以一种蛋白多糖的形式存在，其中多糖的含量为3060，由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖等组成，其中蛋白含量为2030。灵芝多糖蛋白中的糖链与肽链上丝氨酸或苏氨酸通过-糖苷键连接。多糖和多糖蛋白的分子量为201035.8105 Da，其单糖主要由口葡萄糖为主的杂多糖构成。单糖之间主链以-(13)、(14)糖苷键连接，支链以(16)糖苷键连接7。NIR主要用于确定糖苷键构型及常规官能团。在50
10、04000cm-1对多糖进行红外光谱扫描，-糖苷键常在840cm-1出现峰，-糖苷键常在890cm-1出现峰；在10101100cm-1若有3个强吸收峰则可判定为吡喃糖苷，若有2个峰则为呋喃糖苷；810、870cm-1是甘露糖的吸收峰，1260与1730cm-1是酯基或O-乙酰基的特征吸收峰；3440cm-1处为-OH的吸收峰；2935cm-1处为C-H伸缩振动的吸收峰8。余钰骢9选择浙江赤灵芝子实体热水浸提后的灵芝渣为原料，采用高温高压强酸水解提取灵芝结构多糖，对灵芝结构多糖水解物进行了分离纯化，将分离出的产物单体进行近红外定性分析，通过近红外光谱检测器对GLP1和GLP2这两种组分的结构进
11、行分析，发现这两种组分都具有多糖典型的吸收峰，并且初步断定为B型多糖，HPLC纯度检验表明，GLP1和GLP2均为均一的多糖组分，通过HPLC出峰时间计算出GLP1的Mn为1489D，GLP2的Mn为4913D。Peng等10也用SepharoseCL-6B柱层析从松杉灵芝菌丝体的胞外粗多糖中提取了2种杂多糖，分别为EPF1和EPF2，通过近红外色谱(NIR)、气相色谱、核磁等方法对它们的结构组成进行了研究：2种杂多糖均含有甘露糖、葡萄糖、木糖、半乳糖和葡萄糖胺。何晋浙11等采用沸水回流法从灵芝子实体中提取多糖，经HIO4氧化、Smith 降解及甲基化反应，并利用多糖及刚果红混合液在碱性溶液中
12、的波长的红移变化，通过UV-VIS，IR，GC，GC-MS，NMR 对灵芝水提多糖的结构特征及三螺旋体结构进行分析研究。结果表明: 灵芝多糖含有三螺旋体构型，GC-MS 分析灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，还有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和艾杜糖， IR 及1H NMR 分析多糖为-构型，HIO4氧化、Smith 降解和甲基化分析表明: 多糖主要为( 13) 糖苷键连接构型，并伴有少量的16 位支链键连接的结构，灵芝多糖是由D-葡萄糖单元通过-( 13) 糖苷键连接葡聚多糖，其主要构型特征为( 13) -D-线性连接的骨架结构。Liu等12利用NIR分析两种灵芝多糖GLP和H-GLP，发现H-G
13、LP在2970和1379cm-1处出现了新的吸收峰，验证了H-GLP是在GLP上通过结构改造引入了CH3基团。Xu等13将灵芝子实体多糖GLP羧基衍生化得到C-GLP，两种多糖在5004000cm-1中有相似的红外光谱，但在1601和1421cm-1处的2个强吸收峰证实了C-GLP中羧基的存在。Guo等14用傅立叶变换红外光谱法对灵芝孢子多糖GSG进行分析，样品使用量仅1mg，光谱在890和850cm-1处有吸收峰，分别是和构型的特征吸收峰，此外，1078和1039cm-1处的吸收峰证明了GSG为吡喃糖。郑静15等从赤灵芝子实体原粉中分离提纯得到2种均一多糖GLP1-1和GLP2-2，并应用H
14、PLC、SephadexG-100凝胶层析、NIR、UV等方法对分离得到的2种多糖进行纯度鉴别、组分测定及结构分析。结果表明:多糖GLP1-1是由木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、鼠李糖组成，UV光谱和IR光谱显示GLP1-1和GLP2-2均有多糖的特征吸收，并且具有-吡喃多糖糖基的特征吸收峰；推断GLP1-1 和GLP2-2 为-吡喃杂多糖。综上所述，结合NIR 及1H NMR 谱可以有效地对分离纯化的灵芝多糖的结构进行鉴定。2.3灵芝三萜的检测三萜类化合物是灵芝的另一类重要化学成分。灵芝三萜类成分的种类繁多。截至目前，仅从赤芝中发现的灵芝三萜类成分总数就达135种。灵芝中的三萜类成分主要分布在
15、子实体的外周，随子实体成熟度的提高而递增，有些三萜类化合物很苦，有些则无苦味，因品种、培养条件和不同生育阶段其含量有所区别，苦味的灵芝其三萜类化合物含量一般较高16。灵芝三萜化合物依据分子中所含的碳原子数不同，可分为C30、C27和C24三大类。灵芝三萜化合物依据结构、官能团不同，又可以分为灵芝酸、灵芝酸甲酯、灵芝孢子酸、赤芝孢子内酯、赤灵酸、灵赤酸、灵赤酸甲酯、灵芝醇、灵芝醛、赤芝酸、赤芝酸甲酯、赤芝酮、灵芝内酯、赤芝醛等10余种。灵芝三萜类成分的分子量一般为400600，化学结构较复杂，为高度氧化的羊毛甾烷衍生物17。Fatmawati18等研究表明，C11位的官能团对其药理作用的影响较大
16、，并且C3、C7和C15位所连接的羟基取代基对醛糖还原酶的抑制作用很重要。灵芝三萜类成分质量控制在近红外光谱中研究较少，一般采用薄层色谱法（TLC），在分析灵芝中三萜类化合物时常用的展开系统有甲苯-乙酸乙酯-乙酸（12:4:0.5）、正己烷-乙酸乙酯(1:1)、正己烷-乙酸乙酯-乙醚(1:1:1)、氯仿-乙醚-乙酸乙酯(9:1:1)、甲苯-乙酸乙酯-乙酸(13:4:0.4)19，一般常用的显色剂为10%硫酸乙醇，50%硫酸甲醇，加热后，可通过观察斑点颜色的变化初步判断灵芝中四环三萜酸母核上的不饱和性20。Jiang-Jiang Gao21等，用高效液相色谱法（HPLC）以TSK gel ODS-80Ts色谱柱（150mm*4.6mm，5um）分析了10个赤芝样品及8个不同产地人工栽培赤芝子实体中6种
