《蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、收稿日期 2013-03-16基金项目 国家自然科学基金杰出青年基金项目（31025021） ；上海市教育发展基金会晨光计划项目（10CGB18） ；上海市教委优秀青年教师科研专项基金（nlz10010）作者简介 王欢（1982- ） ，女，博士，讲师，研究方向为昆虫分子生物学和害虫生物防治。蝶蛹金小蜂热激蛋白家族基因表达与热保护功能王 欢(上海农林职业技术学院，上海松江：201600)摘 要: 作为分子伴侣，热激蛋白可起修复变性蛋白与阻止其他蛋白质聚集的作用。为进一步理解蝶蛹金小蜂 Pteromalus puparum 热激蛋白家族的分子伴侣功能，本研究对来自该寄生蜂的 Pphsp90，Pp
2、hsp70，Pphsc70，Pphsp60，Pphsp40 和 Pphsp20 等蛋白的基因在大肠杆菌 Escherichia coli BL21 菌株中进行了过表达。结果表明：除 Pphsp40 外，其余 5个基因均得到高效表达，且表达的重组热激蛋白在高温下（80）具可溶性与热稳定性。其中，Pphsp20 与 Pphsp90 在大肠杆菌中的表达显著提高了高温下（50，1 h）细胞的存活率。离体活性实验证实，利用纯化的融合蛋白 Pphsp20 可减少高温下荧光素酶的聚集现象。据此认为，Pphsp20 与 Pphsp90 均具有大肠杆菌细胞的热保护功能，但 Pphsp20 可以单独发挥作用，而
3、Pphsp90 可能需其他因子协同作用才有保护活性。关键词: 蝶蛹金小蜂；热激蛋白；基因表达；蛋白热稳定性；蛋白纯化Prokaryotic Expression and Thermo-protective Function of Heat Shock Proteins from Pteromalus puparum(Hymenoptera: Pteromalidae)Wang Huan(Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Songjiang, Shanghai, 210016)Abstra
4、ct: Acting as molecular chaperones, heat shock proteins (Hsps) could help fixing denatured proteins and preventing aggregation of other proteins. In order to further understand the function of molecular chaperone of Hsp families in the parasitoid Pteromalus puparum, Pphsp90, Pphsp70, Pphsc70, Pphsp6
5、0, Pphsp40 and Pphsp20 from this parasitoid were over-expressed in Escherichia coli. The results showed that five genes except Pphsp40 were highly expressed and these expressed recombinant Pphsps were soluble and stable under high temperature (80). In vivo experiments, Pphsp20 and Pphsp90 significan
6、tly increased survival rate of E. coli cells under high temperature (50, 1 h). In vitro protection study verified that only purified recombinant Pphsp20 could reduce the aggregation of luciferase under high temperature. The results suggest that both Pphsp20 and Pphsp90 may be involved in thermo-prot
7、ective role in E. coli, and Pphsp20 may work independently while Pphsp90 requires the cooperation with other cofactors. Key words: Pteromalus puparum，heat shock proteins，gene expression，protein thermo-stability，protein purification热激蛋白（heat shock proteins，Hsps）是普遍存在于原核和真核生物中的一类高度保守的蛋白。Feder 和 Hofman
8、n（1999）根据序列相似性和蛋白分子量大小将 Hsps 分为2Hsp110，Hsp100，Hsp90 ，Hsp70 ，Hsp60，Hsp40，Hsp10 和 sHsp 8 个家族。尽管不同生物体同一 Hsp 家族之间有高度序列相似性，但不同 Hsps 家族之间其序列无明显的相似性，功能上也不尽相同。充当分子伴侣是 Hsps 的最主要功能，主要包括阻止蛋白聚体，促进蛋白折叠成正确的构象，将变性蛋白降解或再折叠（Parsell and Lindquist，1993; Sorensen et al., 2003） 。体内实验表明，热激蛋白能够调节胁迫后蛋白的折叠，高水平的热激蛋白可以增强生物的耐热
9、能力（Yahara et al., 1986; Heads et al., 1995; Sorensen and Loeschcke, 2007; Colinet et al., 2010） 。离体实验表明，热激蛋白在高温下被激活（Yonehara et al., 1996；陈忠等, 1999） ，保留部分变性蛋白的折叠能力（Freeman and Morinoto, 1996） ，这可能是热激蛋白在胁迫细胞体内的重要营救机制。蝶蛹金小蜂 Pteromalus puparum 是菜粉蝶 Pieris rapae 的重要寄生蜂。多个热激蛋白家族现已克隆，转录表达实验证实其应对高温胁迫(Wang
10、et al., 2008, 2012)具有类似的及时响应机制，但它们具体的保护功能仍未明确。本研究以蝶蛹金小蜂体内获得的来自 6 个家族的 Hsps（Pphsp90，Pphsp70 ， Pphsc70，Pphsp60 ，Pphsp40 和 Pphsp20）为研究对象，表达出重组蛋白，并研究了其对大肠杆菌 Escherichia coli 细胞的热保护、蛋白热稳定性与离体条件下对荧光素酶的热保护作用，以期初步揭示蝶蛹金小蜂热激蛋白的功能，为重要害虫天敌蝶蛹金小蜂的生物防治利用提供帮助。1 材料与方法1.1 供试昆虫蝶蛹金小蜂、菜粉蝶幼虫和蝶蛹金小蜂寄生的菜粉蝶蛹均采自杭州市郊区。蝶蛹金小蜂在人工
11、气候室（温度 251，相对湿度 80，光周期 14L:10D）内进行续代饲养。菜粉蝶幼虫和蝶蛹金小蜂成蜂分别饲以新鲜甘蓝叶和 20%蜂蜜水（v/v） 。1.2 主要材料与试剂大肠杆菌 TG1、BL21（DE3）菌株及质粒 pET28a、pET28a-EGFP（增强绿色荧光蛋白基因与 pET28a 构建的重组表达质粒）均为本实验室保存。总 RNA 抽提试剂 Trizol 购自 Invitrogen 公司，LA Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶购自 TaKaRa 公司， ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、T4 DNA 连接酶购自Promega
12、 公司，鼠抗 His 单抗购自南京金斯特生物科技公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购自 BBI 公司，融合蛋白纯化所用试剂盒 Ni-NTA HisBind Resins 购自 Novagen 公司，纯化蛋白的脱盐和浓缩所用超滤柱购自 Millipore 公司，蛋白质定量（Bradford 法）试剂盒购自普利莱基因技术有限公司。1.3 重组表达质粒（pET28a-Pphsps）的构建按照 Trizol 试剂的使用说明提取蝶蛹金小蜂总 RNA，用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总 RNA 的纯度和浓度。随后取 1 g 总 RNA 采用 ReverAidTM First Strand cDNA Syn
13、thesis Kit 合成 cDNA 第一链。3根据已经克隆得到的蝶蛹金小蜂 Pphsps 基因序列，设计扩增各 Pphsps 基因 ORF 部分所用引物，正反引物分别引入限制性内切酶位点 BamH 和 Not或 EcoR和 Not（表1） 。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。表 1 蝶蛹金小蜂 Pphsps 基因 ORF 扩增引物Table 1 Primers used for amplification ORF of Pphsp genes from Pteromalus puparum 基因Genes引物序列（53）Primer sequence酶切位点Restriction sit
14、eF：AAGGATCC ATGGAGACTGCAGGAGGA BamHPphsp90 R：AGCGGCCGCTTAATCGACTTCCTCCAT NotF：AAGAATTCATGGCCAAGGCACCCGCA EcoRPpPphsc70 R： AAGCGGCCGCTTAGTCGACCTCCTCGAT NotF： AAGGATCCATGCCTGCCATTGGTATT BamHPphsp70 AGCGGCCGCTTAATCCACCTCCTCCAC NotF：AGGGATCCATGTTCAGACTACCAACA BamHPphsp60 R：A GCGGCCGCTTACATCATACCGCCCAT N
15、otF：CGGGATCCATGGGAAAAGACTATTAC BamHPphsp40 R：AGCGGCCGCTCAATTCGGCAGCGTATC NotF：AAGGATCCATGGCGGACAGCGGCAT BamHPphsp20 R：AGCGGCCGCTTAGTGATGCGCGATGG Not以所得的 cDNA 为模板，进行 PCR 扩增。反应体系为 50 ，包括 35.5 L ddH2O，5 L 10buffer，5 L 25 mmol/L MgCl2，1 L dNTPs (10 mmol/L)，20 mol/L 上游引物和下游引物各 1 L，0.5 L LA Taq DNA 聚合酶和 1
16、 L 模板。扩增条件为 94 3 min；94 30 s，退火 50 s， 72 4 min，35 轮循环；72 10 min，退火温度分别为 50，58，53，54，54和 54。PCR 产物回收纯化后进行测序。将测序无误的 PCR 产物用 BamH和 Not或 EcoR和 Not进行双酶切，对酶切产物进行回收纯化，与用相同酶处理的 pET28a 质粒按照片段载体分子比 3:1（mol/mol）的比例，在 T4 DNA 连接酶的作用下，于 16连接 1618 h 后，转化大肠杆菌 TG1 感受态细胞，接种含抗生素卡那霉素（50 g/mL）的 LB 平板中培养 10 h。挑选单菌落接种于含抗生素卡那霉素（50 g/mL）的 LB 液体培养基中，37、200 r/min 振荡培养过夜，抽提质粒进行 PCR 和酶切鉴定，将重组后的质粒命名为 pET28a-Pphsps。1.4 重组质粒 pET28a-Pphsps 的诱导
