《超高效液相色谱-串联质谱法检测辣椒和肉酱中的苏丹红含量》由会员分享，可在线阅读，更多相关《超高效液相色谱-串联质谱法检测辣椒和肉酱中的苏丹红含量（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、超高效液相色谱-串联质谱联用法检测辣椒和肉酱中苏丹红 I-IV的含量姓 名：李 静职 业：食品科学与检验 鉴定等级：高级单 位：双汇集团日 期：2014-5-16河南省食品高级专家评定定专业论文超高效液相色谱-串联质谱联用法检测辣椒和肉酱中的苏丹红 I-IV 的含量李 静 (双汇集团，462000)摘要：建立了辣椒和肉酱中苏丹红 I、II 、III 和 IV 含量的超高效液相色谱- 串联质谱联用(UPLC-MS/MS)检测方法。样品经 4%氨水乙腈提取后，经尼龙滤膜过滤，超高效液相色谱-串联质谱法检测。本方法中苏丹红 I、II、III 的定量限为1g/kg，苏丹红 IV 的定量限为 5g/kg
2、，线性范围为 1-50ng/mL；在苏丹红 I-IV添加水平为 10-50g/kg 时，辣椒样品中苏丹红 I、II、III 和 IV 的回收率分别为 88%-104%、85%-104%、85%-118% 和 64%-75%，肉酱样品中苏丹红I、II、III 和 IV 的回收率分别为 105%-120%、77%-117%、84%-112%和 62%-73%。关键词：苏丹红；超高效液相色谱-串联质谱联用；辣椒；肉酱引言：苏丹红是一种偶氮类合成工业染料，常用于溶剂、汽油以及鞋、地板等的增色。苏丹红早在 1995 年就被确认为致癌物，苏丹红、也怀疑具有致癌性 1。中国和欧盟等全球多数国家都禁止用于食品
3、生产，但有不少食品生产企业为改善色泽、降低成本仍将其作为食用色素，因此，建立苏丹红的快速、准确的检测方法至关重要。目前，苏丹红的检测方法主要包括液相色谱法(HPLC) 2-4、气相色谱-质谱联用法(GC-MS) 1和液相色谱-串联质谱联用法 (LC-MS/MS)5-8等，前处理方法主要包括中性氧化铝柱净化 2和GPC净化 4等方法。由于GPC净化比较费时，且产生大量废液；而中性氧化铝柱净化具有操作复杂，实验条件要求苛刻，结果重现性差，回收率不稳定等缺点。因此，本文采用提取液直接稀释上样，结合UPLC-MS/MS的高灵敏度、准确定性定量和检测快速等优势，建立了一种应用UPLC-MS/MS法测定复
4、杂基质辣椒和肉酱中苏丹红含量的定性定量分析和确证方法。本方法操作简单，检测快速，灵敏度高，检出限低，结果准确可靠。1 材料与方法1.1 主要仪器Xevo TQ MS 超高效液相色谱-串联质谱联用仪 (美国 Waters 公司)；电子天平( 瑞士 Mettler Toledo 公司)；VX-III 型多管平行振荡器(北京 Targin 公司)；KQ-500DE 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；GL-21M 型离心机( 湖南湘仪离心机有限公司)；氮气发生器(英国 PEAK 公司).1.2 试剂和材料苏丹红 I-IV 标准品(纯度分别为 96.7%、83.3%、91.3%和 75.5%，国
5、家标准物质中心)；乙腈、甲酸(美国 Fisher 公司) ；甲酸铵( 美国 Alfa Aesar 公司) ；氨水(天津科密欧) ；辣椒、肉酱( 市售)。 1.3 标准溶液的配制1.3.1 100g/mL混合标准储备液 分别准确称取10.34mg 苏丹红I 、12.00mg 苏丹红II 、 10.95mg苏丹红 III和13.24mg苏丹红IV标准品于100mL容量瓶中，用丙酮定容，混匀，即为100g/mL的苏丹红混合标准储备液，4冰箱中储存。1.3.2 1.0g/mL混合标准中间液 准确吸取1.00mL 100g/mL混合标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容，混匀，即为1.0g/mL的混
6、合标准中间液，储存于4冰箱中。1.3.3 混合标准系列 用4% 氨水乙腈将苏丹红混合标准中间液稀释成1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0ng/mL的标准系列。1.4 仪器条件1.4.1 液相色谱条件 色谱柱： Waters BEH-C18 柱，2.150mm ，粒径 1.7m；柱温：40；进样量：5L；流动相：A：5mmol/L 甲酸铵+0.1%甲酸水溶液，B：乙腈，洗脱梯度见表 1 所示。表 1 罗丹明 B 流动相的洗脱梯度时间(min) 流速(mL/min) A(%) B(%) curve0.0 0.45 30 70 /2.0 0.45 0 100 线性变化3.0 0.45
7、 90 10 线性变化4.0 0.45 30 70 即时变化1.4.2 质谱条件 采用ESI +多反应监测(MRM)模式，电离电压3.0 kV，源温150，雾化气温度450，雾化气流量900L/h ，锥孔气流量 20L/h，碰撞气为高纯氩气，苏丹红I-IV的选择离子多反应监测条件见表2所示。表 2 MRM模式下苏丹红I-IV的监测条件名称 定性离子对 定量离子对采集时间（s ）锥孔电压(V) 碰撞能量(eV)249.25/156.22 20苏丹红 I249.25/232.25249.25/156.22 0.161 2013277.29/121.23 22苏丹红 II277.29/156.202
8、77.29/121.23 0.078 2016353.29/156.20 20苏丹红 III353.29/196.15353.29/156.20 0.078 3422381.32/106.22 24苏丹红 IV381.32/156.10381.32/106.22 0.161 30301.5 样品处理称取处理均匀的样品 2.000.01g 于 50mL 聚丙烯离心管中，加入 10mL 4%氨水乙腈，于多管平行振荡器上振荡提取 30min，超声提取 15min，7000r/min离心 5min，吸取 1mL 上清液过 0.22m 有机滤膜，滤液供液相色谱- 串联质谱联用仪测定。2 结果与讨论2.1
9、 质谱条件的优化苏丹红在ESI +电离模式下易得到 H+形成较为稳定的M+H +的分子离子，本试验对1g/mL 苏丹红混合标准溶液进行全扫描和子离子扫描，获得苏丹红I-IV的母离子扫描图和特征碎片离子扫描图(如附录所示) ，选择丰度比最强的碎片离子对249.25/156.22、277.29/121.23、353.29/156.20 和381.32/106.22分别作为苏丹红I 、II、III和IV的定量离子对，丰度比较强的离子对249.25/232.25、277.29/156.20、353.29/196.15 和381.32/156.10分别作为苏丹红I、II 、III和IV 的定性离子对，优
10、化后的多反应监测条件如表 2所示。2.2 液相色谱条件的优化在ESI +电离模式下，为了使苏丹红更容易得到H +，在流动相中加入微量甲酸，可显著提高目标物的检测灵敏度；添加适量铵盐可改善苏丹红的峰型。为了将色谱柱中的极性和非极性杂质尽可能完全洗脱，从而延长色谱柱使用寿命，本文采用梯度洗脱，最终选用表1中的洗脱程序对目标化合物进行洗脱。2.3 定容液的选择用纯甲醇、纯乙腈、乙腈+水(1+1，V/V )和甲酸+乙腈+水(2+10+88，V/V/V)定容时，苏丹红 III 和苏丹红 IV 均出现双峰，后峰灵敏度是前峰的 2-3 倍，改用在甲醇或乙腈中加入一定量氨水时，随着氨水比例的增大，前峰越来越小
11、，后峰越来越大，当氨水比例增至 4%时，前峰响应变为后峰的 1%以下，可以忽略。考虑苏丹红的非极性较强，且加热处理会对苏丹红 IV 有较大影响，所以定容液与提取液应保持一致，最终选用 4%氨水乙腈定容。2.4 提取试剂的选择 7-8本试验对比采用纯乙腈、正己烷和 4%氨水乙腈作为提取试剂对苏丹红回收率的影响，试验表明三种提取试剂对苏丹红 I、II 和 III 的提取效果差别不大；而采用 4%氨水乙腈作为提取试剂时，苏丹红 IV 的回收率明显上升，这可能因为采用纯乙腈或正己烷提取时，需加热或氮吹置换定容液，而加热和长时间放置对苏丹红 IV 的稳定性影响很大，综合考虑各方面的影响和操作的方便性，最
12、终选用 4%氨水乙腈作为提取试剂。2.5 净化方法的选择考虑到样品提取后脂肪含量较高，且苏丹红的非极性较强，无法用正己烷去油，本试验选用 226 免疫亲和柱和中性氧化铝柱净化。结果表明 226 免疫亲和柱能吸附 50%以上的苏丹红；而采用中性氧化铝柱净化时，在上样的过程中已有 90%以上的苏丹红被洗脱，可能是由于中性氧化铝柱的活性不好控制造成，综合考虑回收率和净化效果，结合超高效液相色谱-串联质谱的高灵敏度，最终选用样品不经净化，增大稀释倍数后直接上机。2.6 线性方程和定量限 按1.3.3配制苏丹红标准溶液，按1.4建立的仪器条件进行测定。分别以定量离子峰面积y对含量x(ng/mL)作标准曲
13、线。以定量离子对的10倍信噪比为定量限，苏丹红I 、II、III的定量限均为0.2ng/mL ，苏丹红 IV的定量限为1.0ng/mL，采用阴性样品中添加目标化合物的方法，按1.5的方法进行前处理，得到本方法中苏丹红I 、II、III的定量限为1g/kg，苏丹红IV 的定量限为5g/kg。纯标品和加标试验的总离子流图如附录所示。2.7 加标回收率和精密度取处理均匀的阴性辣椒和肉酱样品，按表 3 设计试验。结果表明，苏丹红I、II、III 和 IV 在辣椒样品中的回收率分别为 88%-104%、85%-104%、85%-118%和 64%-75%，RSD 分别为 3.7%-5.8%、3.7%-6
14、.8%、6.0%-7.4%和 5.0%-5.9%；在肉酱样品中的回收率分别为 105%-120%、77%-117%、84%-112%和62%-73%，RSD 分别为 2.7%-5.3%、3.3%-7.5%、4.4%-9.9% 和 3.9%-6.6%。具体结果如表 3 所示。表 3 苏丹红 I-IV 的加标回收率和精密度结果添加浓度 辣椒片 肉酱项目回收率(%) RSD 回收率(%) RSD(g/kg) 1 2 3 4 5 6 平均 (%) 1 2 3 4 5 6 平均 (%)10 94 95 97 104 96 99 97.5 3.7 120 110 106 105 105 108 109.0
15、 5.3 苏丹红 I 50 96 103 92 88 89 97 94.3 5.8 112 106 114 112 110 108 110.4 2.7 10 98 95 93 104 85 100 95.8 6.8 110 99 117 96 101 109 105.3 7.5 苏丹红 II 50 90 95 89 85 87 90 89.5 3.7 83 77 84 81 84 83 82.1 3.3 10 99 99 112 118 114 106 108.0 7.4 108 111 100 103 112 109 107.1 4.4 苏丹红III 50 97 99 95 85 88 97
16、 93.6 6.0 85 89 84 106 96 102 93.8 9.9 10 75 67 71 68 67 65 68.6 5.0 69 73 65 70 69 71 69.4 3.9 苏丹红IV 50 67 75 65 64 67 70 67.9 5.9 70 65 73 62 64 70 67.3 6.6 结束语：本试验研究了复杂基质辣椒和肉酱中苏丹红 I-IV 含量的检测方法，采用 4%氨水乙腈提取，UPLC-MS/MS 测定。本方法中苏丹红 I、II、III 的定量限为1g/kg，苏丹红 IV 的定量限为 5g/kg，线性范围为 1-50ng/mL，辣椒样品中苏丹红 I、 II、III 和 IV 的回收率分别为 88%-104%、85%-104%、85%-118%和64%-75%，肉酱样品中苏丹红 I、II、III 和 IV 的回收率分别为 105%-120%、77%-117%、84%-11
