《dna,rna提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,pcr技术,限制性内切酶简介》由会员分享，可在线阅读，更多相关《dna,rna提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,pcr技术,限制性内切酶简介（116页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分子生物学讨论,PART 1,1.DNA提取的原理和方法 2.限制性核酸内切酶切割的原理和方法 3.DNA琼脂糖凝胶电泳结果和分析及其应,人类基因组DNA提取,主要内容,1、基因组DNA 2、质粒DNA 3、细胞器DNA,CTAB法 SDS法 其它方法,碱裂解法 煮沸法,差速离心法,基因组DNA,CTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留
2、在溶液里 该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,CTAB法流程图,SDS法,SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，
3、蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 SDS法DNA提取缓冲液,SDS法流程图 （以动物组织为例）,其它方法,浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同，将二者分离 有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用 密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,质粒DNA,碱裂解法,碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时
4、，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,煮沸法,煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA,差速离心
5、法,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 差速离心法原理 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,DNA提取的基本步骤,材料准备,细胞裂解,核酸分离、纯化,核酸沉淀、溶解,End,限制性核酸内切酶,一、限制性内切酶的发现 1限制性核酸内切酶： -是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。
6、它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字，仅型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可识别230种不同的DNA序列。 2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制(Restriction)和修饰(Modification)系统（R-M系统）。,二、概念,核酸酶：催化核酸酯键的水解 核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3端或5端）逐个水解下核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部切断3,5-磷酸二酯键 限制性核酸内切酶：在细菌细
7、胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶,三、限制性核酸内切酶的分类,1、第一型（Type I）： 既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解； 2、第二型（Type II）： 只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位 点可知、固定是，是最常用的限制性核酸内切酶； 3、第三型（Type III）： 同时具有修饰及认知切割的作用,徐师大-屈艾老师制作,28,四核酸内切限制酶的类型,徐师大-屈艾老师制作,29,五、型核酸限制性内切酶的基本特性,1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激活； 2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列 通常有4-8个bP甚
8、或更多，大都为一回文对称的结构（即识 别序列） 3 . 一般可在特异性识别序列内切割双链DNA分子（有例外），产生链的断裂，断裂端有粘性末端和平齐末端之分。 c,徐师大-屈艾老师制作,30,表：几种常见的限制性核酸内切酶,徐师大-屈艾老师制作,31,六、识别序列,识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文序列。 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。,徐师大-屈艾老师制作,32,七、 切割类型 检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种排列方式之
9、一： （1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段（ 3- 和 5- ）； （2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平齐末端的DNA片段。,八、末端,粘性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的就是黏性末端,意义： 1、便于连接：只要粘性末端互补就可以连接； 2、5端标记：凸出的5末端可以用DNA多核苷酸激酶进 32 P标记。凸出的3端可以通过末端转移酶 添加几个多 聚核苷酸的尾巴(如AAA或TTT等） 造成人工粘性末端； 3、补平成平齐末端：在DNA聚合酶
10、的作用下补齐末端,平末端：而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端,徐师大-屈艾老师制作,36,九、产生的末端特征 我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构（若是-3），它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来。 平末端的DNA片段与粘性末端相比，则不易于重新连结，耗能多。,有些限制性酶(约10种，如BbV等)，其识别序列不表现为回文结构，它们降解双链DNA时，酶切点大部分不在识别序列内，而是与识别序列相距5至13个核苷酸残基不等,徐师大-屈艾老师制作,38,十影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1）,DNA的纯度 DNA的甲基化
11、程度 酶切消化反应的温度 DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 关于限制性内切酶的星活性,徐师大-屈艾老师制作,39,1 、 DNA的纯度 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。 若污染了在DNA制剂中的某些物质后 例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸EDTA、SDS十二烷基硫酸钠、以及高浓度的盐离子等 都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。,徐师大-屈艾老师制作,40,为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： 增加核酸内切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。（加大成本） 扩大酶催化反应的体积
12、，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 延长酶催化反应的保温时间。,41,在有些DNA制剂中 （尤其是按微量碱法制备的） 会含有少量的Dnase （活性需要有Mg2+的存在）的污染。 而在DNA的贮存缓冲液中含有螯合二价金属离子的EDTA，因此在这种贮存制剂中的DNA仍然是稳定的。 然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后（内含Mg2+ ），DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况，唯一的办法就是使用高纯度的DNA 。,徐师大-屈艾老师制作,42,2、 DNA的甲基化程度 限制性核酸内切酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈地影响酶的活性。 为避
13、免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备的质粒DNA。,徐师大-屈艾老师制作,43,3、 酶切消化反应的温度 不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37，但也有许多例外的情况。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37 例如SmaI是25、ApaI是30；有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37，例如MaeI是45、Bcl I是50、MaelII是55；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60以上。 消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至
14、最终导致完全失活。,徐师大-屈艾老师制作,44,4、DNA的分子结构 DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。 此外，还有一些核酸内切限制酶，切割它们自己的处于不同部位的限制位点，其效率亦有明显的差别。据推测，这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差异造成的。,徐师大-屈艾老师制作,45,5、限制性核酸内切酶的反应缓冲液 核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括： 氯化镁或醋酸镁， 氯化纳或醋酸钾 Tris-HCl（-AC）, -巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT) 牛血清白
15、蛋白（BSA） 酶活性的正常发挥，是绝对需要二价阳离子的，通常是Mg2+。购买时厂家会提供专门的缓冲液并有说明其成分。有些核酸内切酶可以在2种甚至4种缓冲液中均有较高的催化活性。,对绝大多数限制酶来说，在pH=74的条件下，其功能 最佳，一般为pH68。,徐师大-屈艾老师制作,46,6.星活性 在“非最适的”反应条件下 (包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等) 有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象称为Star活性。,有些核酸内切限制酶的切割特异性，受所用的缓冲液成份
16、的影响比较明显。 例：EcoRI限制酶，在正常的情况下，是在G AATTC识别序列处发生切割作用的，但如果缓冲液中的甘油浓度超过5（体积分数），那么其识别序列的特异性就会发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星活性，以EcoRI*表示。,徐师大-屈艾老师制作,47,七、限制酶消化反应的步骤 例：0210 ugDNA进行消化的典型反应步骤如要对更大量的DNA进行消化，则反应的各个成分须相应放大。 将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18ul。 加入2ul适当的10X限制酶消化缓冲液。轻敲管外壁以混匀之。 加入12单位限制酶，轻弹管外壁以混匀之。,徐师大-屈艾老师制作,48,将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 加入05molL EDTA(pH80)使终浓度达10mmolL，以终止反应。 如果消化后DNA直接进行凝胶电泳分析，可加入
