微生物限度检查若干问题.

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1、微生物限度检查若干问题微生物限度检查若干问题微生物限度检查是对非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，是药品微生物学检验的重要内容之一。中国药典2000年版二部附录J“微生物限度检查法”、中国药品检验标准操作规范（2000年版）及参考书药品微生物学检验手册均做了详尽的阐述。下面对几个比较重要的问题，谈一点工作学习体会，仅供参考。一、实验室要求开展微生物限度检查工作，首先要按照药品检验所实验室质量管理规范及药品生产质量管理规范的要求，建立一个布局合理，使用方便，操作安全的实验室，并且配有完善的实验设施和管理制度。微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物检定实验室以及接种室（接种

2、对照菌及菌种传代）均应严格分开。（一）无菌室：1结构与要求：最好设在二楼以上（防潮、防霉、采光好），面积不超过10平方米，高度不超过24米，由2个缓冲间和操作间组成。缓冲间与操作间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙、无死角。无菌室内光照应不低于300勒克斯，缓冲间和操作间均应装有紫外线杀菌灯2-25w/m3作空气消毒用。紫外线波长200-300nm者具有杀菌作用，其中以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。其杀菌机理可能是在DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰DNA复制

3、，导致细菌变异或死亡。紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳每次开灯照射时间为20min。其缺点：穿透力弱，一张纸可以挡住，不能穿透固体物，对人的皮肤眼睛有损伤，所以紫外线灯开关应装在无菌室外便于开关。2温度、湿度：温度应控制在18-26相对湿度40-60操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正比不低于49Pa。3操作间：应安装空气除菌过滤层流装置，操作间不应安装下水道，洁净度不低于1万级，净化工作台局部应为100级。操作间应准备电子称（感量01g最大称量300g乙醇灯火柴2碘酊及75乙醇棉球，大、小橡皮乳头，记号笔，灭菌的剪刀，镊子、注射器等。4缓冲间：应有洗手盒、消毒液、无菌衣、帽、口

4、罩，拖鞋等，不应放置培养箱和其他杂物。（二）洁净级别及检查方法：通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法。98年国家药监局颁布药品生产质量管理规范把药品生产洁净区空气洁净度划分为四个级别：空气洁净度级别表尘埃数/立方米活微生物数个洁净级别05m5m浮游菌/立方米沉降菌/皿100级35000511万级35万2000100310万级350万2万50010尘埃数：用尘埃粒子计数器测定，取样高度离地面1米，间距05-2米每个测试点连续采样3-5次，仪器显示结果。沉降菌数测定：无菌室及净化工作台面消毒擦拭后，先启动层流净化装置30min，将营养琼脂平板3个及改良马丁琼脂平板3个直径9cm，置净化台左、中

5、、右各1个开盖，暴露30min后将盖盖上。分别在30-35培养48h及25-28培养72h细菌和真菌总数不超过1个为100级。无菌室应在每次操作前后均用01苯扎溴铵溶液或其他消毒液擦拭台面及紫外线照射不到可能污染的死角；用消毒液湿拖地面。实验室一旦被污染洁净度达不到要求可以清洗或更换净化工作台过滤器甲醛或丙二醇乳酸熏蒸消毒方法：支架上放一个烧杯（内装少许甲醛，8ml/平方米下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯点燃后，关闭门窗，乙醇用尽后灯自灭，甲醛蒸气充满无菌室，密闭24h。缺点：甲醛蒸气易锈蚀仪器，对人有刺激，可用氨水中和，减少对人眼的刺激。二、无菌操作指在无菌的环境条件下，使用无菌的器材，防止微

6、生物污染的操作技术。从事微生物检验的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识培训，才具备上岗操作的资格。所用的物品需清洗、干燥、包扎，无菌。干烤箱1602h适用于培养皿9cm、试管、吸管、锥形管、剪刀、镊子物品的灭菌；培养基及09氯化钠溶液用高压锅湿热灭菌含糖培养基一般用11330min以防温度过高成分被破坏；一般培养基11530min;09氯化钠溶液可用12120min即可。操作者在缓冲间换拖鞋，用肥皂洗手后，穿戴无菌工作服、帽、口罩，操作前用01苯扎溴铵泡手75乙醇棉球擦拭双手后在乙醇灯火焰区操作。操作中切勿用嘴直接吸吹吸管防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。三、药品微生物

7、检验的特点（一）活体易变性：被污染的供试品中活的微生物具有繁殖能力，如细菌以二分裂法无性繁殖，20分钟繁殖一代，一个细菌10个小时后可变成10亿个细菌。如糖浆剂细菌数标准为100个/ml，出厂时检验结果合格，由于贮存不当，放置一段时间成为不合格药品，由于营养成分耗尽细菌自身代谢产物所致的毒性或pH值改变细菌逐渐死亡，又成为合格药品。（二）分布不匀：由于生产环节多，从原料、中介体到成品，经过生产多个流程，与不同操作人员接触，特别是生产后期被污染，通常是局部的，药品微生物的污染存在着不均性。要求：随机取样，二个包装以上，操作前，供试品摇匀后取样。（三）受损状态：药品中污染的微生物，受到加工、加热过

8、程的机械损伤，药品本身的抑菌杀菌作用，处于受损抑制状态，检验时必须创造适宜的生长环境（培养基的营养、pH值等）使细菌复苏，从而提高检出率。如口服制剂，必须检查控制菌大肠杆菌，取1:10的供试液10ml加入胆盐乳糖增菌液中，胆盐乳糖增菌液是分离大肠杆菌的选择培养基，蛋白胨乳糖等成分提供氮源碳源外，胆盐是抑菌剂，对革兰阳性菌有良好的抑菌作用，从而使目的菌更好地生长。（四）生态环境多样复杂性：药品的种类、剂型繁多，使污染的微生物生态环境多样而复杂。故对不同的供试品分别采用不同的方法，正确地制备供试液，使药品中污染的微生物得以真实反映，是保证检验结果正确可靠的重要前提条件。四、供试液的制备：将供试品制

9、成供试液（一般为1:10），有利于供试品中污染的微生物分散，与培养基充分接触，提高阳性检出率。常用稀释剂为09无菌氯化钠溶液，滴眼剂、王浆、蜂蜜制剂可直接用供试品（原液），作为供试液。在作10倍递增稀释时，吸管插入第1级稀释液内不低于25cm，上下反复吸吹约10次。吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管，贴于试管内壁调整液量至刻度，再沿第2级稀释管的内壁在液面上1cm处缓慢吹出全部液体。每个稀释级需更换吸管。（一）一般供试品供试液的制备：1液体制剂：糖浆剂等取样10ml至含有玻璃珠的锥形瓶内，加入09无菌氯化钠溶液90ml1:10的供试液。油剂：取样10ml加聚山梨酯-805ml再

10、加稀释剂至100ml。不提倡将稀释剂定量分装后再灭菌，因高压灭菌易使液体蒸发损失。2固体制剂：片剂：称样10g至研钵量取稀释剂100ml，先加10ml浸没样品，研磨，将上层液倒入锥形瓶，再加少许稀释剂研磨，同上操作直至样品全部研细制成1:10的供试液。丸剂及锭剂：中药蜜丸取4丸以上剪碎后称样10g放置匀浆仪专用的不锈钢匀浆杯内，加入稀释剂100ml，3000转/分2min制成1:10的供试液。胶囊：硬、软胶囊，称样10g，加入稀释剂100ml放45水浴10分钟后振摇使溶解。肠溶片（胶囊）、稀释剂用无菌磷酸盐缓冲液pH68100ml。茶剂：称样10g加稀释剂100ml浸泡30min，用无菌纱布过

11、滤取滤液（1:10的供试液。袋泡茶取2袋称量加稀释剂配成1:10浸泡30min。胶剂：如阿胶，先放4冰箱1h取出后立即称样10g，放入匀浆仪内捣碎或用无菌的不锈钢捣罐捣碎，放45水浴促溶。气雾剂：不含抛射剂的可拧开取样10ml，加稀释剂90ml1:10含抛射剂，需先放4冰箱1h减压，然后用无菌钢锥钻孔（勿拨出钢锥），转动钢锥使抛射剂徐徐抛出，再用无菌注射器抽出全部药液，然后按标示量用稀释剂补足为原液，以下操作同液体制剂。乳膏剂：称样10g，加聚山梨酯-805ml促溶加稀释剂至100ml。非水溶性供试品：司盘单硬脂酸甘油酯法：眼膏、软膏剂，以凡士林为基质，不溶于水需加乳化剂使供试品乳化。用减量法

12、称样5g，加入含已灭菌溶化并保温45左右的司盘-805g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯-8010g混合物的烧杯中，在45水浴中振摇使供试品中凡士林基质乳化慢慢加入45左右的09无菌氯化钠溶液85ml边加边振摇制成1:20供试液。（二）抑菌性供试品供试液的制备抑菌及抗菌性药品，如抗生素、沙星类，既然有抑菌杀菌作用，为什么还要做微生物限度检查，其原因是：被污染的微生物在抗菌药品中因生存环境不利，呈休眠受损状态，但未死亡，一旦用于人体，当条件改变或适宜时，便复苏仍可生长繁殖，对人体造成危害。有的耐药性致病菌株可成为对该抗菌药的依赖株。抗细菌的药品，不能抗真菌，所以可能被真菌污染；抗真菌的药品不能抗细

13、菌，所以可能被细菌污染，故2000年版药典要求口服抗生素抗细菌的药品检查真菌，抗真菌的药品检查细菌。细菌数及真菌数的测定，供试品未经特殊处理，因三级稀释，基本上可起到稀释后消除抑菌成分的作用。1稀释法：取1:10的供试液10ml加入增菌液在200ml以上2沉降法：制成1:10的供试液摇匀后静置10min，使药品中污染的微生物混悬于供试液中，难溶于水的抑菌成分自然沉降在容器底层，吸取上层液10ml至增菌液。1、2法适合于抑菌性弱的药品。3薄膜过滤法：由于细菌的直径约1m利用045m微孔滤膜阻截细菌，滤除抑菌成分，冲洗膜上残留抑菌成分，达到消除抑菌成分之目的。如氯霉素滴眼液，取1:10的供试液40

14、ml，通过直径为50mm装有045m孔径微孔滤膜的无菌滤器，过滤后用09无菌氯化钠溶液冲洗，冲洗量约1000ml，无菌手续取出滤膜放至无菌平皿内，剪成四等份，各取一片分别放置营养内汤增菌液二瓶（其中一瓶加入金黄色葡萄球菌50-100个及胆盐乳糖增菌液二瓶其中一瓶加入铜绿假单胞菌50-100个。同时做阴性对照（加稀释剂10ml）。凡士林基质的眼膏、软膏减量法称样10g，加十四烷酸异丙酯20ml摇匀使凡士林基质溶解后徐徐加入09无菌氯化钠溶液80ml1:10边加边摇静置待分层取水层20ml加稀释剂至100ml，过滤，冲洗（量1500ml剪膜操作同上。4离心沉淀法：利用供试品药物颗粒及细菌不同物质质量的差异，在离心力的作用下达到分离的目的。一次离心法：取1:10的供试液20ml分别放至二支尖底离心管内各10ml，其中一支管内加入阳性对照菌50-100个3000转/分5分钟，弃去上层可溶性抑菌成分。二次离心法：操作同上，第一次离心500转/分，3分钟弃去沉淀药渣及不溶性抑菌成分;第二次离心3000转/分5分钟弃去上层可溶性属抑菌成分取沉淀物约05ml加至增菌液中。5中和法：如磺胺类药品，1:10的供试液摇匀后，先用沉降法，弃去沉淀（因磺胺药几乎不溶于水，沉于管底，污染菌在稀释剂中），取上层液10ml加入含1对氨基苯甲酸05ml的增菌培养基中，即可中和磺胺类药的抑菌作用。