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1、大蒜中超氧化物歧化酶的分离纯化以及其特性探究摘要：本文描述从大蒜中提取超氧化物歧化酶的一种简单易行、经济实惠的方法。其分离纯化分为三个部分：PBS氯仿-乙醇提取，丙酮沉淀和DEAE离子交换层析。大蒜SOD的酶活力为4124U/mg，回收率为53.3%，浓缩系数是192。SDS-PAGE电泳分析显示大蒜SOD具有高度的一致性，当pH为4-11时，SOD的酶活将会在很大程度上被氰化物和过氧化氢抑制。经验证，温度低于50或超声波处30min，酶的活力仅有轻微的减少，大蒜SOD的最大吸收峰值为269nm。关键词：超氧化物歧化酶，大蒜，提纯，色谱法1.引言 虽然大蒜药用已经有几千年了，但是直到最近才研究
2、其作用方式。大蒜不仅可以抑菌、抗病毒、抑制真菌和原生动物，而且对心血管和免疫系统有很好的功效1。很多年来来，对打算的研究报告一直集中在其作为抑菌要的方面，从而忽视了其他的药理学作用2-5。及其有报道称大蒜SOD有其独特的药理作用。6对于生命有机体，超氧化物歧化酶（SODEC1.15.1.1）是一种十分重要的金属螯合酶，可催化有害的超氧化物阴离子歧化生成过氧化氢和氧分子。基于其抗氧化作用，SOD一直被用于医学治疗、化妆品和其它化学工业7.8.目前大部分的SOD都是从动物血浆或植物细胞中提取，这些组织中含量低，提取工艺复杂，提高SOD的生产成本，这限制了它更广阔的应用。研究表明，打算是含有SOD最
3、为丰富的植物，100g大蒜中的SOD酶活力范围2000-3000U，远超过另一种SOD含量丰富的植物刺梨，然而，之前很少有研究大蒜的SOD及其作用机制。直到现在，大蒜的研究只是涉及SOD的详细分子结构和部分药理作用。本文介绍了一种有效、经济实惠的提取纯SOD的方法，这不仅为后续成本低廉可生物再生新型的提取方法提供方向，也对大蒜SOD的药理功能的进一步探究奠定了基础。2.材料和方法2.1原材料大蒜（中国广州市购买），标准牛血SOD（天津应用生命科学研究所）2.2大蒜的预处理去皮，将蒜瓣放入搅拌器到捣碎2.3磷酸缓冲液提取100g蒜泥中加入300mL磷酸缓冲液（50mmol/L，pH7.4）室温下
4、浸提40min，再用200mL磷酸缓冲液反萃取大蒜渣两次，过滤，取清液。2.4氯仿-乙醇提取氯仿和乙醇3:5（体积比）混合，500mL酶提取液加入130ml的有机溶剂，搅拌15min，离心（10000g）15min。上清液道路分液漏斗静置15min，弃去水相，将酶相倒入真空蒸发仪50浓缩至124ml。离心（10000g）10min，沉淀杂质，取上清液进行酶活和蛋白质含量的测定。2.5丙酮沉淀法缓慢地向上清液中加入冷丙酮（-20），轻轻搅拌15min，离心（10000g）15min，取沉淀，溶解在磷酸盐缓冲液中，4透析12h。2.6 DEAE离子交换层析梯度解析：用2.5mmol/L（pH7.0
5、）至300mmol/L（pH7.8）的磷酸缓冲液以1.1mL/min的洗脱速率进行洗脱。收集各级样品。检测每一部分的蛋白质含量和酶活力，将含酶的部分统一进行透析除盐和冷冻干燥处理。2.7 SDS-PAGE电泳根据Laemmli9的12.5%聚丙烯酰胺凝胶实验，利用SDS-PAGE电泳分析酶的浓度，0.1%考马斯亮蓝R-250对蛋白质染色。2.8蛋白质测定采用lowry10等人的方法，牛血SOD为标准物，测定蛋白质含量2.10大蒜SOD的pH 稳定性的测定用下列的缓冲液调节纯化酶的pH值（pH2.0-11.0）HCl/CH3COONa (pH 2.04.0)，CH3COONa/CH3COOH (
6、pH4.05.5)，NaH2PO4/Na2HPO4 (pH 5.57.5)，TrisHCl (pH7.59.0)和NaHCO3/Na2CO3 (pH 9.011.0)，37，30min，牛血SOD作比较，测定酶活力的最佳pH为7.8。2.11大蒜SOD的热稳定性酶溶解在不同温度的磷酸缓冲液（0-70），保持60min，测定酶活。2.12紫外线对大蒜SOD的影响0，4r/s超声波处理(ACX 400 Ultrasonicator, 20 kHz, Sonic and Materials, Newton, MA, USA)，15s，测定酶残余活力。3.实验结果3.1大蒜SOD的提取和纯化3.1.1
7、磷酸缓冲溶液提取磷酸缓冲液提取大蒜SOD三次，实验结果如表1所示，实验表明，两次提取可以达到总酶活力的99%。表1.磷酸缓冲液提取大蒜SOD提取次数总酶活力（U）总酶活性的提取百分比（%）12580091.7221007.532400.83.1.2氯仿-乙醇提取氯仿-乙醇处理后，SOD活力仅减少4.8%。当总蛋白浓度下降81.6%时，酶比活力提高3417.2%，如表2所示表2.氯仿-乙醇提取大蒜SOD总酶（mg）总酶活力（U）蛋白质浓度（%）酶比活力处理前12962790010021.5处理后2092702016.1129.33.1.3减压蒸馏减压蒸馏除去酶溶液中残余乙醇，当酶比活力增加48.
8、7%时，总蛋白质浓度和总酶活力分别降低23.6%和9.22%3.1.4丙酮纯化随着丙酮浓度增加，上清液的酶活力和蛋白质浓度都减少（图1），向酶提取液中加入等体积的冷丙酮，酶活力只有轻微的减少，蛋白质则下降40%。随着丙酮的增加，酶比活力也在不断增加（图2），丙酮浓度达到50%时，酶比活力达到最大（527.4U/mg）高浓度的丙酮（1.5L/L）会造成酶活力的急剧下降58%。图1 图23.1.5离子交换层析纯化大蒜SOD从DEAE柱上洗脱下来有3个含蛋白质的部分，只有第一部分含有SOD活性，如图3图3 3.1.6 SDS-PAGE电泳SDS-PAGE纯化大蒜SOD如图4所示，大蒜SOD（35mm
9、）的阻滞因素Rf与标准牛血SOD一样，由两个统一的单元组成，各自的组成的分子量15500Da表3对大蒜SOD提纯步骤进行总结比较。经过磷酸缓冲液提取、氯仿-乙醇提取、丙酮纯化和DEAE离子交换层析一系列纯化步骤，获得纯度相同的大蒜SOD最终的酶比活力为4124U/mg，产率53.3%图4表3 大蒜SOD的纯化过程准备阶段体积(mL)总酶活力(U)蛋白质含量(mg)酶比活力(U/mg)酶收率纯化(fold)磷酸缓冲液54027900129621.51001氯仿59027020209129.396.86.0真空12424562154159.588.07.4丙酮762120040.2527.476.
10、024.5离子交换77148473.64124.2532191.83.2大蒜SOD的性质3.2.1 大蒜SOD的紫外吸光度大蒜SOD的紫外吸光度为269nm，同时也发现在280nm处有一个吸收峰（图5）图53.2.2大蒜SOD的pH稳定性碱性环境有利于大蒜SOD活力的保持，尤其是pH高于6.0时（图6）当环境的pH低于3时酶活力下降90%。牛血SOD在pH2-11的范围中表现出良好的稳定活性图6 3.2.3大蒜SOD的热稳定性温度低于50时，酶活力只有轻微的下降（图7），然而温度超过60时，酶活力丧失12%，牛血SOD也有同样的趋势。图73.2.4大蒜SOD的超声波稳定性超声波处理30min后
11、，酶活力降至92.8%（图8），结果表明。超声波对大蒜SOD酶活力影响很小。图84.结果讨论尽管很长一段时间以来，大蒜都被认为包治百病，但对大蒜SOD的研究很少，本文介绍了一种有效、经济实惠的提取纯化SOD的方法。首先是磷酸缓冲液提取接着是氯仿-乙醇去蛋白，酶比活力提高417.2%蛋白质浓度下降380%，这表明，该方法对于杂蛋白的去除十分有效，同时也表明大蒜SOD（Cu、Zn-SOD）可能对氯仿、乙醇不敏感。通过减压真牛，去除参与的乙醇，同时浓缩酶溶液。减压蒸馏的温度控制在50-55，同时也有一个热处理的效果。由于SOD的热稳定性，在纯化SOD时通过加热处理去除杂蛋白12-14，因此，减压蒸馏
12、使得纯化过程无需加热。使用阴离子交换层析纯化大蒜SOD的过程中，检测到酶活力大量丧失，同时比活力也很低（实验数据未列出），造成这种现象的原因可能是酸性条件下，羧甲基纤维素吸附SOD的金属辅基。Namir等在研究紫草提取SOD的试验中也报道同样的结果15.在阴离子交换层析中SOD不同的表现分子结构的不同，尤其是相关的活性中心的金属离子的差异15根据催化中心的金属辅基不同，现已经从植物中发现了3种不同的类型的SOD:Cu/Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。不同类型的SOD通过抑制剂的敏感度加以区别15，氰化物处理后，大蒜SOD的酶活力大约损失90%。再用1.5mmol/L过氧化氢处理，处理
13、后酶活力大约损失88%，这表明大蒜的SOD是Cu/Zn-SOD而不是Mn-SOD和Fe-SOD，原因是Fe-SOD仅受过氧化氢的抑制而Mn-SOD对两种试剂都不敏感。大蒜SOD的紫外吸光度为269nm，而在280nm处未观察到吸光度，这是由于SOD中缺乏色氨酸且酪氨酸含量低。同时Cu离子存在，在可见光谱中的吸收峰在680nm。据报道所有不同来源的Cu/Zn-SOD的紫外吸光度都接近于260nm比如牛血SOD（258nm），菠菜SOD（258nm）和卷心菜SOD（254nm），而Mn-SOD和Fe-SOD则接近于280nm，这一结果进一步证实了大蒜SOD是Cu/Zn-SOD大蒜SOD的阻滞因素（
14、Rf）和移动距离与标准牛血SOD一样是由两个分子量分别为15500Da的亚基组成，在SDS电泳的两者高度的一致性表面大蒜SOD是由两个亚基组成16-18在pH由4-11的范围中，减刑条件更加适合大蒜SOD，因为混合的大多数蛋白质的等电点大约是4.0，由此可推测，在纯化大蒜SOD 的时候等电点沉淀法也是一种有效去除杂蛋白的方法。温度低于50的时候，大蒜SOD热稳定性比较好。因此大蒜SOD在如下许多方面有优势：实际范围的pH和热稳定性，超声波稳定性，广泛丰富的来源。大蒜SOD不仅可以简化纯化过程，而且在商业生产有巨大的潜力。虽然目前大蒜SOD在临床药理学的研究只是一个开端，当大蒜的SOD的广泛应用
15、很快就会研究透彻。本文为大蒜SOD 的结构特性提供了最基本的证据，只有蛋白质的生化分析才能进一步研究其生理功能。参考文献1 J.C. Harris, S.L. Cottrell, S. Plummer,D. Lloyd, Antimicrobial properties of Allium sativum (garlic), Appl. Microbiol. Biotechnol. 57 (2001) 282286.2 E. Wills, Enzyme inhibition by allicin, the active principle of garlic,Biochem. J. 63 (1956) 514520.3 S. Shoji, K. Furuishi, R. Yanase, T. Miyazka, M. Kino, Allyl compounds selectively killed human deficiency virus-type1-infected ce
