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1、实时荧光定量PCR技术及其应用摘要：实时荧光定量PCR 技术是在PCR 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，具有操作简便、快速高效，高通量，而且高敏感性等特点，该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR 的原理、主要类型、优点、影响因素及应用等进行了综述。关键词：实时荧光定量PCR 类型 优点 影响因素 应用实时荧光定量PCR技术(real-time fluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是1996年由美国
2、Applied Biosystems公司推出的一种新技术,它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。1目前，该技术已广泛应用于分子生物学、医学等学科和基础研究领域，特别是在现代农业转基因作物的定性检测、品系鉴定、转基因成分含量的检测中发挥着重要作用2。1 实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR 的原理是以荧光共振能量转移原理为基础。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct 值
3、是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct 值是实时荧光PCR 中一个很关键的因素，C 代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR 产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR 相比，实时荧光定量PCR 可以利用荧光信号实时监测PCR 反应过程中每一个循环扩增产物的变化，可以对初始模板量进行定
4、量分析。简单地说，实时荧光定量PCR 的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA 含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。2 实时荧光定量PCR 技术的主要类型荧光定量PCR 所使用的荧光化学材料可分为两大类，即荧光染料和荧光探针。荧光染料以SYBR Green为主要代表，是非特异性荧光化学材料。荧光探针包括TaqMan、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等，属于特异性荧光材料。2.1 SYBR GreenSYBR Green是一种
5、能够与双链DNA 小沟结合的染料。在游离状态下，SYBR Green发出微弱的荧光，但是一旦与双链DNA 结合，其荧光强度大大增强。因此，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA 量成正比，可以根据荧光信号检测出PCR 体系中的双链DNA 的数量3。其优点是检测方法简单，通用性好，价格相对较低，是许多实验室开展荧光定量实验的首选。SYBR Green的缺点在于它能够和所有的双链DNA 相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构、非特异性扩增产物引起的荧光信号会影响定量的准确性。但可以通过优化PCR 的反应条件、选择设计良好的引物，来减少或去除引物二聚体和非特异性产物的产生；另外，也可以通过对扩
6、增产物的溶解曲线进行分析来判断荧光信号的真实性。2.2 TaqMan 探针TaqMan 探针技术是有美国Perkin Elmer（PE）公司研制的一种实时PCR 定量技术，在PCR 扩增加入一对引物的同时加入1 个特异性的荧光探针，此荧光探针为一个3045 bp的寡核苷酸，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对，其5端标记荧光发射基团，3端标记荧光淬灭基团。当探针保持完整时，3端淬灭基团抑制了5端发射基团的荧光发射。但在PCR 扩增中，模板变性后低温退火，引物与探针同时与模板结合，在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq DNA 聚合酶的53外切酶活性将探针
7、5端连接的荧光发射基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3 端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号。由于被释放的荧光基团数目和PCR 产物数量是相对应关系，且荧光强度同被释放的荧光基团的数目也是正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量4。TaqMan 探针技术特异性好、准确性高、假阳性低、重复性比较好。但是需要设计特异性的探针，因此成本较高5。2.3 分子信标分子信标技术是一种呈发夹结构的茎环状双标记寡核苷酸探针，环部与靶DNA 序列互补，为1535 bp；茎部是由互相配对的碱基组成，但与靶DNA 无序列同源性，约8 bp。在探针的5端和3端分别标记荧光发射基团和荧光淬灭基团。
8、当溶液中的模板与分子信标结合配对时，分子信标的构象改变成链状使得荧光发射基团与淬灭基团分开，当荧光基团被激发时，就发出荧光信号。与探针互补的靶分子数量越多，荧光信号也就越强，从而实现了对目的基因的定量检测。分子信标的方法优点是特异性强，荧光背景低。其缺点是设计困难，杂交探针不能完全与模板结合，稳定性较差，价格高6。3 荧光定量PCR与常规PCR的比较荧光定量PCR是将荧光技术应用于PCR,即使用荧光染料或荧光标记的探针,与PCR过程中的扩增产物结合,在PCR的每一次循环中,都可观察到荧光强度的变化,这种变化对应于扩增产物量的增加,通过绘制标准曲线,最终可得到反应初期的靶基因数量。荧光定量PCR
9、用特定的仪器将PCR的扩增、检测和结果分析结合在一起,实现了真正意义上的实时绝对定量,相比于常规PCR具有许多优点。3.1实时测定,节约时间常规RT-PCR在PCR反应后,常需要使用凝胶电泳其染色(EB为致癌物质)、DNA测序、Southernblot等方法对结果进行人工或自动化定量,这些后续步骤不仅使测定时间变长,而且在样品的传递过程中还增加了污染的机会,而荧光定量PCR不需要扩增后的这些处理就可直接对待测样本实时定量同时,从逆转录开始到完整定量结束的整个过程都可实现自动化,这极大地节约了时间和劳动量。3.2重复性好,测定偏差小PCR的重复性可用循环阈值来衡量,在荧光定量PCR过程中,连续不
10、断地监测反映体系中荧光信号的变化,当信号增强到某一阈值(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值)时,此时的循环次数即为循环阈值。荧光定量PCR循环阈值的变异系数在2%以下,而常规RT-PCR变异系数多在14%左右,毫无疑问,实时逆转录PCR比常规PCR的测定偏差明显减小。3.3灵敏度高,特异性好常规PCR有时为提高灵敏度,常需要进行二次扩增,但这同时也降低了特异性,增加了污染的可能性和假阳性错误。而对于荧光定量PCR,其高灵敏度不需要进行二次扩增,这将减少假阳性机率。因此,荧光定量PCR在提高反应灵敏度的同时,也保证了其特异性。4 影响实时
11、荧光定量PCR试验结果的因素从DNA出发进行定量相对比较简单，一般在保证引物及探针的特异性、PCR 反应体系的合理性以及DNA 模板的纯度和完整性的情况下，可以保证试验的顺利进行。从RNA 出发对mRNA 进行定量时，操作比较复杂，影响试验结果的因素也比较多。4.1 RNA 的完整性因为RNA 一旦降解所定量的结果就不能正确反映样品中mRNA 的量，所得的结果也是错误的。所以在RNA 提取过程中要严格遵守操作规范，避免RNA 酶的污染7-8。4.2 RNA 样品中的基因组DNA 污染提取的RNA 样品中不可避免地混有少量的基因组DNA。基因组DNA 对试验有两个影响：一是影响对RNA 的精确定
12、量；二是影响PCR 扩增的特异性。4.3 PCR 反应体系的优化PCR 扩增过程必须保证扩增产物只有特异的目标产物，为此，首先要保证PCR 反应体系达到最优。目前许多公司都有用于实时定量PCR 反应的试剂盒，可以方便PCR 反应的操作。4.4 反转录反转录所得cDNA 的量必须精确地等于相应的mRNA 的量，反转录对于实时定量PCR 来说是非常关键的一步。目前常用的反转录酶有2 种：AMV-RT 和MMLV-R。反转录常用的引物有随机引物、Oligo-dT 和特异引物。相比之下Oligo-dT 和特异性引物更适合实时定量PCR9。4.5 利用实时定量PCR 研究基因表达时，一般用相对定量的方法
13、相对定量必须用到内标基因。可靠的内标基因应是在不同细胞类型、不同试验条件下都稳定表达的持家基因。常用的内标基因有-tublin、actin、GAPDH、18sRNA、efla 和Cyclophilin 等10。尽管在大多数情况下这些持家基因的表达非常稳定，但是最近有报道认为这些持家基因的表达在某些情况下会发生变化。也就是说并不是任何内标基因都适合任何试验。在选择内标基因时，应仔细考虑各种因素，选择合适的内标基因或内标基因组合。5 实时荧光定量PCR方法的应用实时荧光定量PCR技术已经广泛地应用于基因表达的定量(细胞因子、生长因子、转录因子等)和等位基因的鉴定(单核苷酸多态性的检测)等分子生物学
14、基础研究领域11。同时,由于其能够快速、简便地扩增微量DNA序列,且特异性好、灵敏度高和操作简单等特点,被广泛地用于各种病原体的检测(病毒、细菌、真菌、寄生虫等)的检测监控以及定量分析。5.1植物病害检验检疫实时荧光PCR技术由于其高特异性和灵敏性的特点,目前被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方式,已经成为植物病害诊断中新的可靠方法12。甚至一些尚不能得到纯培养的病原菌可以实时荧光定量方法检测出来,并且通过内参基因和定量样品的处理可以对其在植物组织中的菌量进行定量检测13。王中康14等已经建立了柑桔难培养韧皮杆菌的实施荧光检测方法,利用该方法不仅可以定性、定量检测出不同组织中柑桔黄龙病菌,
15、还对病菌在其传播媒介昆虫-柑桔木虱体内的循环进行了深入研究15。P.Kogovsek16通过荧光RT-PCR快速检测出PVYNTN之间潜在的块茎坏死和标准PVYN分离菌株,该方法还可以探测到PVYO株系,敏感性高于ELISA法7个数量级。在出入境检验检疫中,实时荧光定量检测由于其高灵敏度和快速可靠操作简便的特点而成为首选检验方法。刘红光等17利用荧光定量的方法检测了柑橘衰退病,其检测灵敏度较常规PCR提高了100倍;郭京泽等18根据辣椒轻斑驳病毒衣壳蛋白区域编码序列,设计了辣椒轻斑驳病毒的特异TaqMan荧光探针,检测结果只有感染辣椒轻斑驳病毒的样本进行荧光PCR检测呈阳性,而烟草花叶病毒、黄
16、瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒的荧光PCR检测都呈阴性,所建立辣椒轻斑驳病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,是DAS-ELISA法的100倍;李博等19依据萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种的16S23SrRNA间隔区ITS序列,设计引物CfbF/CfbR.PCR扩增3个糖甜菜叶斑菌及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191bp产物。已经有大量检疫性植物病害有了规范化的实时荧光检测方法,而荧光检测的高灵敏度使其可以进行无症带菌样品的检测,为重大疫害生物的非疫区建设提供了保障,保证了植物生产安全。5.2医学和动物检疫动物检疫对畜牧业的发展至关重要,而且一些动物病害还直接威胁着人体的健康。近年来,疯牛病、绵羊痒病已被证实与人的克雅氏病有直接关系。因此,国际上严格禁用肉骨粉作所有牲畜的饲料用途,动物源性食品、某些日用消费品的
