基因工程实验.

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1、1.动物细胞DNA提取原理是什么?答:先用SDS裂解细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提,使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面,DNA则留在水相中,离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇,除去多糖物质和沉淀DNA,然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤,最后用ddH2O溶解沉淀DNA,20保存。2.DNA提取中用到了哪些试剂?有什么作用?EDTA:二价金属离子螯合剂,螯合Mg2+,抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。SDS:一种阴离子去污剂,在高温(5565)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白质变性,释放出核酸。酚:使蛋白质变性。氯仿:作为除杂

2、剂,除去糖、脂等杂质;加速有机相与液相分离;抽提核酸溶液中残留的酚。乙丙醇:作为消泡剂;降低DNA的水溶性,让DNA从溶液中析出;有利于分层,使离心后的上层含DNA水相,中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。无水乙醇:降低DNA的水溶性,沉淀DNA。醋酸纳:调PH,中和Tris-Buffer,形成中性环境,利于DNA沉淀。Tris-Buffer(PH8.0):提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏。70乙醇:清洗溶液中离子及其他杂质。NaCl:提供高盐环境,使DNA溶解于液相中。2. 有机溶剂使用注意事项? 答:有机溶剂的容器,不论是否在使用中,都应随手盖紧。尽可能在通风位置工作,以避免吸入有机溶

3、剂的蒸汽。尽可能避免皮肤直接接触。3.PCR原理?答:将目的基因DNA在高温(94)下解链成为单链模板;人工合成的一对与目的基因两侧序列相互补的寡核苷酸引物在低温(4060)下分别与变性的目的基因片段两侧的两条链的部分序列互补结合;在中等温度(6575)下,由耐热的DNA聚合酶(Taq酶)将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3,-OH末端,并以此为起点,沿着模板以5,3,方向延伸,合成一条新的互补链。4.PCR类型?反转录PCR怎么做的?答:反向PCR、巢式PCR、锚定PCR、数字PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR、免疫捕捉PCR等。RT-PCR的原理:提取组织或细胞中的总RNA,以plo

4、yA(A)+选择性RNA为模板采用oligo(dT)、随机引物或基因特异性的引物GSP经反转录酶的作用从RNA合成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,获得目的基因或检测基因表达。5.PCR影响因素?答:引物;模板;DNA聚合酶;Mg2+;底物;反应缓冲液。6.PCR体系有什么物质?作用?答:引物:是两段与待扩增目的DNA序列侧翼片段具有互补碱基特异性的寡核苷酸,使DNA聚合酶以其3,-OH末端为起点合成互补链,决定了特定基因的扩增。模板:提供DNA复制的模板,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子。TaqDNA聚合酶:将dNTP中的脱氧单核甘酸加到引物3,-OH末端,并以此为起点,

5、沿着模板以5,-3,方向延伸,合成一条新的互补链。底物dNTPmix:4种脱氧核苷酸,提供PCR反应的原料和能量。反应缓冲液:反应缓冲液一般含有Tris-HCl、KCl和适当的Mg2+。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂,Tris-HCl起缓冲作用,KCl有利于引物的退火。7.怎样提高PCR产物的特异性?引物:a.典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。 b.选择GC含量为40到60或GC含量映像模板G

6、C含量的引物。 c.设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。 d.避免引物对3末端存在互补序列,这会形成引物二聚体,抑制扩增。e.避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。f.避免3末端的错误配对。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 g.避免存在可能会产生内部二级结构的序列,这会破坏引物退火稳定性。Mg2+:浓度通常为0.52.0mmol/l,过高或过低均影响产物的特异性。模板:模板量应适宜,过量则可能增加非特异性。延伸时间:应适宜,时间过长会导致产物非特异性增加。循环次数:一般为30个(2530个)周期,如果循环次数过

7、高,会增加非特异性产物及其复杂度。8.PCR都有哪些酶可以用?答:TaqDNA聚合酶;TthDNA聚合酶;Vent聚合酶;PfuDNA聚合酶。见实验书69页。9.T4 DNA连接酶连接的原理?答:T4 DNA连接酶作用机制:酶先与ATP形成酶-AMP共价复合物,再与DNA作用、AMP转移至DNA缺口5,-磷酸基上形成焦磷酸键而活化5,-磷酸基,然后再与3,-羟基形成磷酸酯键,完成连接过程。10.PCR产物与T载体怎样连接的?答:PMD18-T质粒0.5uL,PCR产物4.5uL,2solution(含T4DNA连接酶)5uL,混匀后16水浴过夜。11.DNA用试剂盒是怎么回收纯化得到的?答:依

8、据吸附柱中的硅胶膜在高盐浓度下特异性吸附DNA,在低盐浓度下可被洗脱的原理。按照100mg胶块加入700uL溶胶液的比例,55溶胶。将融化的胶溶液转移到吸附柱中,离心后倒掉收集管中的废液,将吸附柱放入同一收集管,加漂洗液离心洗涤,重复漂洗一次,去掉废液后放回吸附柱空转,尽量去除多余溶液。再将吸附柱放入新的收集管中加入洗脱液,静置离心后去掉吸附柱,即为纯化产物。12.DNA回收的注意事项?答: 加入的胶块溶化液的量要足量,保证胶能完全溶解,避免堵塞硅胶模确保WB液中已经加入了酒精把胶液倒入柱子后要静止2min以后再离心,使DAN完全吸附于膜上洗脱液要滴在膜中央,以充分洗脱结合在膜上的DNA。将离

9、心后的洗脱液倒掉后,要在空离心。13.连接为何在16?答:因为黏性末端的DNA双键间有氢键的作用,温度过高使氢键不稳定,但连接的最适温度恰为37,所以经综合考虑,采用16较为合适。14.载体与目的基因连接时各自的量有什么讲究?答:连接时外源基因的量要多一些,载体的量要少一些,这样碰撞的机会就会多,否则载体自身环化就严重,一般载体DNA与目的基因连接采用1:(1-3)的比。连接酶的用量不宜过多。15.Cacl2制备感受态原理?答:将细胞培养至OD600为0.4-0.6后放入冰浴中使其停止生长,然后将菌株置于低温预处理的低渗Cacl2 溶液中,即造成细胞膨胀,细胞通透性发生暂时性的改变,从而极易与

10、外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物16.转化?感受态?以及其的影响因素? 答:转化:是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。感受态:指宿主细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的一种生理状态,它是由宿主菌的遗传性所决定,同时也受菌龄;外界环境因子等的影响。影响因素:细胞的生长状态和密度、CaCl2处理时间、热击时间、感受态细胞的保存期、质粒DNA的质量和浓度、试剂的质量、防止杂菌和杂DNA的污染、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。17. 制备感受态的方法有哪些?(大肠杆菌、农杆菌、酵母)(1) 大肠杆菌感受态制备方法:CaCl2法制备(2)

11、 农杆菌感受态制备:CaCl法制备,类似于大肠杆菌的方法。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl溶液中,0oC下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变,此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70oC可保存相当一段时间而不会对其转化率有太大影响。(3) 酵母感受态制备: 18.热击转化的原理?答:利用CaCl2处理感受态宿主细胞,然后通过热击法处理,即置于42高温6090s,细胞布朗运动剧烈,膜流动性增强,由于感受态细胞细胞膜有受伤,DNA进入细胞,然后降温在培养基上生长,表达足够的蛋白质,以使能在抗生素的平板上生长菌落。19.蓝白斑筛选的原理?答:许多载体都带有一个大肠杆菌

12、DNA的短区段,包含-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控区和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),这种载体适合转入可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的受体细胞。宿主和质粒单独编码的片段仅是-半乳糖苷酶的部分序列,单独存在时没有酶活性,但它们同时存在时,可形成具有酶活性的蛋白质,即为互补。由互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷)的作用下,在无色底物X-Gal存在时产生蓝色沉淀底物,使菌落显蓝色。如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后,无法实现互补,使得带有重组质粒菌落形成白色菌落。20.LB的配方答:LB培养基:1胰化蛋白胨、0.5酵

13、母提取物、1Nacl。即10g胰化蛋白胨,5g酵母提取物,10g氯化钠溶解在950ml水中,用1mol/LNaOH调至7.2在补足水至1L。固体培养基在LB培养基中添加1.52琼脂,121灭菌20min备用。21.灭菌的过程?121,灭菌20min。首先往高压蒸汽灭菌锅内添适量水,然后把培养基放入锅内,锅盖对称拧紧。待压力升至0.05MPa时,打开排气阀,排完气后,关闭排气阀。待压力再次升至0.1MPa时,开始计时,直至升至0.15MPa时关闭电源开关。待压力将至0.1MPa时,打开电源开关,升至0.15MPa时关闭电源。如此循环,20分钟后,关闭电源,直到压力降至0时,打开排气阀,最后打开锅

14、盖取出培养基。22.涂板前在LB上371h?答:质粒只有在大肠杆菌中跟随其复制,使拷贝数增加,转录翻译出足够的酶,才具有抗性。23.转化常见方法?答:大肠杆菌:化学转化法、电击法。动植物细胞:显微注射法、农杆菌转化法、基因抢法。24.质粒DNA提取原理?答:基于环状质粒DNA相对分子质量小,易于复性的特点。在热或碱性条件下DNA分子双链解开,若此时将溶液置于复性条件下,变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性。经过离心除去变性的染色体DNA和蛋白质杂质沉淀,上清液中的DNA分子则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。25.溶液、有什么作用?成分是什么?答:solution:含葡萄糖,T

15、ris-Hcl(PH8.0),RNA酶和EDTA。葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部;Tris-Hcl(PH8.0)提供一个适当的PH环境;EDTA螯合二价金属离子,抑制DNase的活性;RNA酶降解RNA。solution:含NaOH和SDS。NaOH使染色体DNA氢键断裂,双螺旋结构解开而变形形成杂乱无章的片段,同时使质粒DNA的大部分氢键发生断裂;SDS用于溶解细胞膜上的脂肪和蛋白质。solution:含NaAc或KAc(PH4.8),用于中和solution中的碱性溶液,使得质粒可以复性,而染色体DNA则不能复性,从而经离心后把质粒分离出来。26.TAKARA公司都有哪些产品?有什么用途?(酶、载体类型等)27.限制性内切酶识别、切割有什么特点?答:识别和切割双链DNA分子内特殊的核苷酸序列。其切口有两种类型:平末端和黏性末端。28.星号活性的影响因素?答:甘油体积分数过高(5%);酶过量(100u/uL);离子浓度低(8.0)等。29.T载体的结构?(从大连宝生物下载说明书阅读。)T载体是一种高效克隆PCR产物(TA的克隆)的专用质粒载体,为线性化载体,线性化后两侧3端各多出一个脱氧胸苷酸(T),无需酶切可直接与游离A末端的

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