pcr技术及其应用-2014.9

《pcr技术及其应用-2014.9》由会员分享，可在线阅读，更多相关《pcr技术及其应用-2014.9（97页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1,PCR技术及其应用,张文举 生命科学学院,2,这些事件有何联系？,末代沙皇尼古拉二世 1918年的流行性感冒病毒 电影侏罗纪公园 辛普森杀妻案 曹操姓曹么？,这些事件都运用到了PCR技术！,3,DNA是最重要的生物大分子之一,DNA分子经过多个层次的包装,DNA双螺旋,4,DNA及其复制,半保留复制,一系列因子帮助DNA的复制,5,复制叉,6,DNA聚合酶,1）总是从5-3端复制； 2）DNA的复制需要一小段RNA作为“引物”,5-3端复制,一段RNA作为“引物”,7,PCR技术的发明,基因克隆的需要催生了PCR的发明 1953年 DNA双螺旋结构的发现 1956年 DNA聚合酶的发现 1

2、985年 PCR的发明 DNA聚合酶的分离 “引物”的合成 使极少量的DNA样本进行了大量的扩增！,8,多聚酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）,PCR技术的原理 PCR技术的衍生技术 实时荧光PCR技术 PCR技术的应用,9,PCR技术的基本原理,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR反应过程 PCR的特点 PCR的操作步骤,10,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,5,3,11,PCR的基本原理,PCR反

3、应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,12,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,13,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,14,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,15,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,16,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2n n 循环次数

4、实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数,17,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,18,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,19,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） 实现了在试管中模拟细胞内的DNA复制。 然而，采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,20,PCR技术简史,核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明 PCR的完善,1988

5、年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，特异性、真实性也较高，但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,21,PCR技术的基本原理,PCR反应过程 PCR的特点 PCR的操作步骤,22,PCR技术的基本原理,PCR反应过程 PCR的特点 PCR的操作步骤,23,PCR技术的基本原理,PCR反应过程 PCR的特点 PCR的操作步骤,24,

6、设置反应程序,(1) 94变性5min， (2) 94变性1min， (3) 52 退火1min， (4) 72 延伸1min。 (5) 72 延伸10min。,重复(2)-(4)30次,25,PCR结果：1、对照(无模板)； 26、PCR产物（5ul样品）,PCR产物的电泳鉴定,26,（1）模板 单、双链DNA均可，多种来源。 质量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般人基因组100ng DNA模板（100L）。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（为什么？）,PCR反应的影响因素 1)反应体系,Lambda DNA，模板量分别为100 pg,

7、10pg, 1pg, 100fg , 10fg,27,（2）引物 引物是与待扩增DNA片断两翼互补的一段特异的寡核苷酸片断。 引物是PCR反应中最关键的因素，因此引物序列的设计对于PCR是否成功是非常重要的。,28,1.引物长度： 以18-24 bp为宜。 （为什么？） 2.碱基均衡分布： 四种碱基尽可能随机分布； G+C占40-60%，上下游引物应基本一致。 3.避免形成二级结构： （为什么？） 发夹结构、二聚体。 4.引物的两端： （为什么？） 3端为关键碱基；5端无严格限制。,引物设计的原则：,29,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,30,5.引物的

8、特异性： 引物序列应避免在模板内有较高相似性的系列，尤其是3末端。,可以在www.ncbi.nih/blast.cgi进行在线比较 通过OMIGA、Clustal X等软件进行两两或多序列的比较。,引物序列同源性比对：,31,引物设计,引物设计常用软件主要有： Primer Premier 5.0 Oligo 6 primer 3 The Primer Generator Net Primer,32,1. 将序列输入软件中,两个方法,33,（2）打开原有的序列文件,34,在对话框中输入待扩增序列 点击左上角的“Primer”按钮,35,2. 设置相关参数,36,3. 得到的引物结果,37,Ha

9、irpin: 引物自身是否会形成发夹结构 Dimer: 同一种引物是否会形成二聚体 False primiring: 引物在待扩增序列中其他位置是否有配对 Cross Dimer: 正向与反向引物间是否会形成二聚体,38,39,改动后引物的信息,40,重新回到双引物的界面,41,“Edit”“Copy”“Sense Primer” 5 CGCCTCGAGAAAAGACAGGACTCCACCTCA 3,4. 输出引物序列,42,引物纯度：公司合成引物常用的纯化方式C18脱盐、OPC 纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。 普通PCR：OPC纯（95%） 较长引物（大于50个碱基） ：PAGE纯（95

10、%） 经过修饰或标记的引物：HPLC纯（ 99%,但价格昂贵） 引物浓度：0.1-0.5 mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降。 （为什么？）,43,*生物科技有限公司的引物合成服务,44,（3）耐热DNA聚合酶,1）Taq DNA聚合酶（Taq polymerase） ： 95的半寿期为40min 最适温度（72）时每个酶分子每秒可催化合成150个核苷酸 酶活性（受多种因素影响）： 53方向的聚合酶活性， 53方向的外切酶活性和逆转录酶活性， 非模板依赖性活性，可在双链PCR产物每一条链的3端加上单核苷酸尾，使PCR产物的3端突出一个单A核苷酸尾,45,Tth DNA聚合

11、酶：在高温和MnCl2存在的条件下，能有效地逆转录RNA。用于一步法RT-PCR。 Vent DNA聚合酶：又称Tli DNA聚合酶，该酶耐高温且具有3-5外切酶活性的校对功能，其保真性较Taq DNA聚合酶高一倍。该酶扩增长片断（12kb）的功能较强。 Pfu DNA聚合酶 ：具有35外切酶活性的校对功能，催化DNA合成的忠实性比Taq聚合酶高12倍，但不适于2kb的片断扩增。,2）其他的耐热聚合酶,46,（4）dNTP 四种dNTP浓度应相等 dNTP浓度：100200mol/L 浓度过高，影响DNA聚合酶的活性，且易产生错误碱基的掺入 浓度过低则降低反应产量。 UNG酶可降解dUTP替代

12、扩增产物,47,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 dNTP、EDTA等负离子的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。,48,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性。,49,（3）延伸 70-75oC， 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效

13、率降低，错误掺入率增加,50,二、PCR的衍生技术,逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR） 反向PCR（inverse PCR） 巢氏PCR（nesting PCR） 原位PCR（in situ PCR） 多重PCR（multiplex PCR） 多重等位基因PCR（multiplex allele PCR） 不对称PCR（asymmertric PCR） 锚定PCR（anchored PCR） 长片段PCR（long fragment PCR） 荧光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）,51,逆转录酶,DNA聚合酶活

14、性,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,1、逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),52,影响因素,（1）模板对RT-PCR的影响 对RNA制品的纯度和完整性要求都极为严格 （2）逆转录酶对RT-PCR的影响 MLV逆转录酶能合成大于2kb的较长cDNA，但对热的稳定性较AMV逆转录酶差。 （3）逆转录引物对RT-PCR的影响 随机引物：原核细胞多用 oligo(dT)：真核细胞多用 基因特异性的引物（GSP）：特异性强，广谱性低,53,例子： S.pn的转化对PsaA基因mRNA表达的影响,a、RNA的提取： 野生型和转化缺陷型S.pn都诱

15、导转化后，采用Qiagen试剂盒进行总RNA提取。 b、cDNA的制备： 取RNA 2l，随机引物1l，DEPC水9l，混匀后，70变性5min，立即置于冰上。然后顺序加入逆转录buffer 5l，dNTP 1.5l, RNasin 0.5l, DEPC水5l, 逆转录酶M-MLV 1l。混匀后于37，1小时，得到cDNA。 c、PCR扩增: PsaA的引物3L，cDNA 1L，Tag plus酶0.2L，共30L体系。循环参数：94 30秒，55 40秒，72 45秒，循环30次。用16s rRNA的PCR产物为标准物，2%琼脂糖电泳。,54,电泳结果用软件Quantity-one 3.2进行半定量比较，结果进行配对t检验分析,16S(463bp) PsaA(254bp),图2， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA mRNA的表达。,1 2 3 4 5 6 7,图1， 2号菌株及其转化缺陷菌株在加入CSP后的不同时间PsaA 的RT-PCR电泳图。 line1: Marker2. line2-4: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2 was added CSP. line5-7: 0min, 10min, 20min after S.pneumoniae No.2d was added CSP.,*,*