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1、反义RNA技术原理及在疾病治疗中的作用 摘要：反义RNA技术是利用反义RNA能够与特异靶RNA通过配对碱基间氢键作用而互补配对，从而在基因复制、转录和翻译3个不同水平上参与基因表达的调控，来治疗各种遗传性或病毒感染性疾病的一项技术。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上，拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。相信随着对基因功能研究的广泛开展及基因治疗研究的深入，反义RNA技术必将成为一种有力的工具，在疾病治疗中起到重要的作用。关键词:反义RNA；基因表达调控；基因治疗 反义核酸技术是继基因克隆和重组技术后分子生物学领域兴起的一种全新的技
2、术。该技术由于其核苷酸具有与DNA意义链相同的序列且可以选择性地抑制特定基因的表达而得名。广义的反义核酸技术包括：反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotides,ASOD)，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸,通过碱基配对与细胞内核酸结合,特异的调节基因表达。反义RNA技术(antisense RNA),是利用基因重组技术,构建表达载体，使其离体或在体内表达出反义的RNA。核酶技术(ribozyme)核酶是一种可自我催化的特殊的反义RNA，能与靶序列结合并使之裂解，从而对特定基因的表达进行调控。反义RNA(antisense RNA)是一种本身缺乏编码能力，但能与特异靶
3、RNA(主要是mRNA)互补的RNA分子，它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA的特定互补区域结合形成双链复合物，抑制靶RNA的功能,从而调控基因的正常表达1。反义RNA技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA，通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA,然后转染受体细胞，则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA即通过和相应的RNA互补而达到阻断其功能的目的。近20多年来,反义RNA技术已在病毒病、癌症、遗传性疾病等疑难疾病的基因治疗、动植物品种的改良以及生
4、物研究方法的改进方面取得了令人瞩目的成就。本文在讨论反义RNA技术的作用机制和与反义寡核苷酸技术的比较的基础上,拟概述反义RNA的作用机制、技术方法与特点、技术运用和存在的问题。 1反义寡核苷酸技术与反义RNA技术1.1反义寡核苷酸技术 1978年,Zamecnik首先应用一种13个碱基的寡核苷酸抑制Rous肉瘤病毒,取得一定效果1,此后,随着对其作用机制、特异性及药理作用等研究的深入,其应用范围不断扩大。由于ASOD的易降解性,在实验中通常要对其进行修饰,硫代反义寡核苷酸作为第一代反义寡核苷酸的代表,由于在细胞毒性、细胞吸收率等方面存在众多问题,Agrawal等设计了第二代混合骨架的反义寡核
5、苷酸(mixed-backbone oligonucleotides ,MBO),MBO含有至少两种不同的化学修饰,在结构上可以是任意两种或多种修饰的不同排列组合。 MBO不仅保持了核酸酶抗性,而且具有很好的靶序列杂交特异性和相对较低的毒副作用2。近年来以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元的多肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)由于可与互补的RNA或DNA形成稳定的PNA/DNA(RNA)杂合链并且具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性而预示了其作为反义抑制剂的用途,被称为第三代反义核酸3,但细胞对PNA的吸收效率较低的问题一直没有得到很好解决。并且,由于寡核苷酸的半衰期较短,有必要反复
6、应用ASOD。事实上,以上三代寡核苷酸较高的制备成本也是妨碍其广泛应用的因素之一。同时,在反义寡核苷酸的设计上还较盲目,要设计出高效的反义寡核苷酸并非易事。相对而言,包含反义RNA的重组质粒则相当于具有生物兼容性和生物降解性的长期释放装置。2 反义RNA作用机制 与ASOD方法相比,设计反义RNA时一般不需要目的基因的详细的调控知识,人们普遍应用由翻译起始位点延伸0.5kb 3.0 kb的片段作为重组质粒的(逆向)插入序列。而全长的cDNA序列一般认为没有必要,尤其当目的基因较长时。另外,互补于3端非翻译的序列也往往具有很好效果4。在真核生物中,一般认为对应5非编码区的反义RNA优于针对编码区
7、的反义RNA。包含反义核酸的重组质粒在细胞内转录出反义mRNA,发挥抑制基因表达的作用。目前,具体的作用机制尚不甚清楚,人们推测可能有: 反义RNA的作用机制主要表现在DNA复制、转录和翻译3个水平上。2.1DNA复制中的作用 反义RNA作为DNA复制的抑制因子,与引物RNA结合或作用于引物前体而抑制DNA复制,从而降低DNA的复制效率。E.coli的colE1质粒复制的前提是合成适当的RNA(RNA),它自动折叠后与DNA模板结合形成DNA复制的引物,从复制起始点上游 445bp处开始,以另一DNA为模板反向转录的RNA正好与RNA的结合,阻止了正常引物的产生,从而干扰复制的进行。2.2转录
8、及转录后水平的作用 反义RNA与mRNA 5末端互补结合,阻断帽子结构形成;作用于外显子和内含子的连接区,阻碍前mRNA剪接;作用于polyA形成位点,阻碍mR-NA的成熟及其向胞浆转运。在crp基因的ticRNA(transcription inhibitory complementary RNA)负向自我调控中,ticRNA与crp mRNA的5端结合,形成类似于RNA聚合酶识别的转录终止信号的二级结构,以反式作用对转录过程本身进行调控5。2.3翻译水平的作用 反义RNA可直接与mRNA的SD序列(含RBS)或编码区(主要是AUG)结合,从空间上直接阻止核糖体的正常结合或可直接降解靶mRN
9、A。反义RNA与mRNA在SD序列配对形成吻触复合体或在互补区段结合形成RNA- RNA双链结构,从而调控翻译的进行。在真核生物细胞中有许多RNA在翻译水平上表现反义RNA的功能。如鸡胚胎肌浆中存在的富含U的小分子RNA称为tcR-NA,它们可以与肌球蛋白重链的RNA的polyA尾杂交而抑制正常的翻译过程。Audrey等6的研究表明FGF- AS RNA在翻译过程能有效地抑制FGF- 2在哺乳动物细胞中的表达。 反义RNA的重组DNA中只有启动子及终止子,当转染细胞后,重组DNA能自动表达反义RNA,并且重组DNA自身可以整合到宿主的基因组DNA中,或作为“附加体”长期存在。在原核细胞中,反义
10、RNA以针对SD序列效果最好,而在真核细胞中以5端非编码区为标靶最有效。3 反义RNA技术方法3.1反义表达载体的构建 一般应用RT-PCR技术克隆出部分目的cDNA,并在两端加上限制性酶切位点倒向插入真核表达载体中,载体一般要含有下游的polyA尾以保证转录产物的稳定。为确定插入方向可应用限制性内切酶酶切或直接测序,曹国栋等人曾介绍一种PCR鉴定重组体DNA插入方向及转染的方法7,可有效解决酶切困难或无适当位点可供选择的问题。下面是一些常用的真核表达载体:应用较广的是含SV40(simian virus 40)、RSV(Rous sarcoma virus)或CMV (cytomegalov
11、irus)的启动子/增强子的质粒载体。尤其CMV的早期启动子/增强子元件可有效的应用于各种人及鼠源的肿瘤细胞系。含EBV(Epstein-Barrvirus)复制起点的载体,可编码核抗原(EBV nuclear antigen),可以以“附加体”形式在细胞中复制,避免了整合入染色体基因组所带来的位置效应。在应用反义RNA技术研究原癌基因在细胞生长、分化及凋亡的调控机制时,人们发现反义RNA对一些原癌基因表达抑制的同时抑制了细胞的生长,从而不利于转化子的筛选8。一种解决办法是选择可诱导型的表达载体,使得筛选后在诱导物的诱导作用下表达出反义RNA并发挥反义作用。1982年,Karin等构建含金属硫
12、蛋白-型(MT- )启动子的可诱导型载体,在适当诱导条件下(如Zn2+、Cd2+等)才能启动下游基因的转录9。应用此类载体进行转染已取得良好效果。构建此类载体时要注意的是诱导物对生物体可能产生的生物学效应,尤其是毒副作用。近年来出现了一类高效且诱导剂生物效应较小的双载体系统,如pVgRXR/pIND(Invitrogen),pTet/pTRE (Clontech),其原理是第一种质粒能够表达能与诱导剂结合的蛋白,细胞在稳定转染了第一种质粒后,再转染第二种含目的基因片段或反义片段的质粒,而第二种质粒的表达受控于能被第一种质粒所表达的蛋白所激活的转录启动子。 pTet/pTRE载体系统已成功地应用
13、于细胞培养及转基因小鼠10。但对于某些细胞系,四环素结合蛋白的高表达对其有一定的毒副作用。3.2基因的导入(转染)磷酸钙法、电转法、基因枪是体外实验中DNA转染真核细胞的常用方法。脂质体不仅常用于体外实验中载体DNA对细胞系的转染,也用于体内实验中的转染过程。脂质体能提高分裂细胞和非分裂细胞对核酸的摄取,并保护其不被降解。优点是操作简单,细胞吸收较好。缺点是包埋的DNA量不确定,体内实验中发现在特定组织如肝脏吸收的倾向性,及对某些组织如脑有一定毒性。在此基础上人们逐渐开发出具有一定良好特性的转染试剂如pH-敏-脂质体。各类受体介导的转染试剂往往使转染更接近自然的生理过程(如基于转铁蛋白受体介导
14、的核酸转染试剂),不仅可能降低毒副作用还可因受体的特异分布而具有转染的组织或细胞特异性。另一种转化策略是以病毒作为载体,同时利用了病毒的转染特性。 rAAV-AS(AAV, adeno-associated virus,腺病毒辅助性病毒)以其安全、高效而广泛应用于反义RNA技术及基因治疗。它几乎可以转染所有哺乳动物,但对其他动物,如家禽,目前尚未建立起其AAV系;并且,由于它的转染是细胞膜上受体介导的,哺乳动物的AAV不能用于家禽的转染11。逆转录病毒在快速分裂的细胞中转染效率也相当高,这使它常被作为载体应用于肿瘤的治疗中,它可应用于哺乳动物及禽类。其不足是它只在快速分裂的细胞中起作用,这使它
15、的应用范围受到一定限制11。一般认为体内的转染需要借助基因的导入系统(gene deliver system),Wolff和Malone等人于1990年用表达-gal及荧光酶基因的质粒分别对小鼠肌肉进行直接体内注射,在注射区域的肌细胞检测到该基因的表达12。直接注射法仅对骨骼肌细胞有效,人们推测可能与骨骼肌的多细胞核、存在胞环流等结构特性有关。为检验转染效率,人们往往选用-gal或pEGFP等报道基因。3.3检验、结果分析 在以反义RNA表达载体进行细胞系的转染或体内实验时,应设置空载体转染的对照实验,以排除外源载体DNA的导入带来的生物学或免疫学效应。体外实验中基因产物的活性、细胞的增殖、分
16、化等生物学参数,体内实验中动物本身的一些生物学表型的改变均是不可忽略的重要指标。在此基础上分子生物学水平的分析主要有以下几个方面:除了以正义探针检验反义RNA的表达情况外,我们更关心的是靶基因的表达情况。应用进行中的核转录分析(nuclear run on transcription assay)能够较可靠的测定基因转录活性。对mRNA水平的检验方法除了Northern印迹,RNA保护试验(RNase protection assay)灵敏度更高,并且可以进行较准确的定量分析。由于目前反义RNA抑制靶基因表达的原理尚在研究之中,而反义RNA抑制靶基因表达的过程中并不一定伴随着mRNA水平的降低13,所以检测反义抑制效果的较为客观的标准是相应蛋白水平的变化。 Western印迹,ELISA
