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1、湖北中医药大学 硕士学位论文 鱼腥草治疗孕妇巨细胞病毒感染的临床及实验研究 姓名：张柳红 申请学位级别：硕士 专业：中西医结合临床 指导教师：李力 20100512 中文摘要 研究课题 鱼腥草治疗孕妇巨细胞病毒感染的临床及实验研究。 研究目的 探讨中药鱼腥草治疗人巨细胞病毒( H C M V ) 感染的疗效。运用高效液 相色谱法( H P L C 法) 测定临床治疗孕妇巨细胞病毒感染的鱼腥草抗病毒 有效成分槲皮素的含量。研究鱼腥草抗病毒有效成分槲皮素体外抗人巨细 胞病毒( H C M V ) 的作用及其作用机制。 研究设计 选用20 0 7 年12 月- - 20 0 9 年6 月，华中科技大
2、学同济医学院附属中西 医结合医院( 武汉市第一医院) 妇产科门诊孕妇1 9 0 0 例进行筛查，检测血 清中人巨细胞病毒H C M V - I g G 、I g M ，发现H C M V - I g M 阳性者6 0 例作为研究 对象。分组给予鱼腥草煎剂及金叶败毒颗粒进行治疗14 天后，复查 H C M V - I g M 转阴率。运用高效液相色谱仪测定鱼腥草抗病毒有效成分槲皮 素的含量，并采用细胞培养实验方法研究槲皮素体外抗人巨细胞病毒 ( H C M V ) 的作用及其作用机制。 治疗和观察方法 1 将H C M V - I g M 阳性者6 0 例按随机数字表法分组：对照组3 0 例，治
3、 疗组3 0 例。对照组用金叶败毒颗粒( 武汉中联药业集团股份有限公司生产， 组成：大青叶、蒲公英、金银花、鱼腥草，每袋10 9 ) 治疗，每日3 次，每次1 袋；治疗组用鱼腥草草药3 0 9 ，由武汉市第一医院煎药室统一煎制而成， 每袋20 0 m 1 一次口服一袋，每日两次，均服用1 4 天。停药1 周后无菌抽 取肘静脉血4m l ，取血清于一2 0 保存，复查H C M V - I g M 转阴率。 2 观察各治疗组治疗后H C M V - I g M 阳性转阴率，采用E L I S A 法检测，试 剂H C M V - I g G 、I g M ，E L I S A 试剂盒购自美国H
4、o p e 公司。 3 H P L C 法测定鱼腥草抗病毒有效成分槲皮素的含量：采用A g il e n t Z O R B A XO D S 色谱柱，以甲醇一0 4 磷酸( 5 2 ：4 8 ) 为流动相；3 6 8 n m 波长 处检测，流速：1 0 m l r a i n - 1 ，柱温：3 0 0 C 。 4 用鱼腥草抗病毒有效成分槲皮素配成不同浓度的溶液，噻唑蓝比 色法( M T T ) 检测细胞毒性，槲皮素不同浓度溶液分别作用于被H C M V 感染 的细胞，通过观察细胞病变效应( C P E ) ，M T T 法检测细胞存活率来探讨槲 皮素对H C M V 感染的细胞治疗作用、对
5、H C M V 在细胞内增殖的抑制作用及预 防作用，从而对其抗病毒机制进行研究。 统计学方法 临床观察计量资料数据均输入S P S S1 3 O 软件作t 检验及x2 检验。 细胞培养实验数据以均数标准差表示，采用S P S S l3 0 统计软件分 析。 结果 1 对照组用药前后H C M V - I g M 转阴率7 3 3 ，P 0 0 5 ) 。 4 4 槲皮素溶液预防巨细胞病毒感染的作用，见表4 。 溶液浓度为0 2 5m g m l 及其上剂量组对巨细胞病毒感染细胞有预防作 鱼腥草治疗孕妇巨细胞病毒感染的临床及实验研究 用，随作用时间延长其预防作用增强，高于病毒对照组( P 0 0
6、 5 ) 。，作用4 8 h 的0 2 5 m g m l 及其上剂量组对巨细胞病 毒感染的预防作用差异无显著性( 尸 0 0 5 ) 。从治疗及预防巨细胞病毒感 染有效及经济角度看，最佳药物浓度均为0 3 0 m g m l 。采用R e e d - M u e n c h 法计算，槲皮素治疗巨细胞病毒感染的E C ，。为0 3 0 m g m l ，T I 为1 5 8 3 。 表3槲皮素溶液对I l c l I y 感染细胞的增殖抑制作用( 均数标准差) 注：与病毒对照组比较，P O 0 5 ；组间相互比较，P O 0 5 2 4 h ：0 1 = 0 15 0 2 0 2 5 0 3
7、- - 0 3 5 = 0 4 = 0 4 5( 6 P O 0 5 ) 4 8 h ：0 1 - - 0 1 5 0 2 0 2 5 = 0 3 - - 0 3 5 = 0 4 = 0 4 5( 6 P O 0 5 ) 湖北中医药大学2 0 10 届硕士学位论文 表4 槲皮素溶液对H C U Y 感染的预防作用( 均数标准差) 2 4 hCPE+ + 抑制率j l4 9 2 6 4 3 8 63 6 1 43 3 3 1 2 7 2 81 9 2 61 3 0 16 5 5 土 8 0 6 5 2 2 5 O l 。2 5 2 。 2 0 5 4 0 1 4 0 02 1 8 4 8 hCP
8、E+ 4 - + +4-4-4-4- 抑制率j I 5 5 0 24 5 9 73 7 0 23 3 2 63 0 0 11 9 8 41 7 2 67 7 2 士 5 0 3 9 5 2 。4 9 9 5 1 1 4 9 3 4 5 3 4 7 92 8 3 + 4 - + 4 - 1 0 0 + + + + 1 0 0 O 注：与病毒对照组比较，P 0 0 5 ；组间相互比较，6 P 0 0 5 2 4 h ：0 1 = 0 1 5 = 0 2 0 2 5 = 0 3 = 0 3 5 = 0 4 = 0 4 5 4 8 h ：0 1 = 0 1 5 = 0 2 0 2 5 = 0 3 =
9、0 3 5 = 0 4 = 0 4 5 l O ( P 0 0 5 ) ( P 0 0 5 ) 鱼腥草治疗孕妇巨细胞病毒感染的临床及实验研究 讨论 1 祖国医学对本病的认识 祖国古代医籍中没有专门关于H C M V 感染的记载，而是根据其发病特 点及临床表现归类为妇科胎漏、胎动不安、小产、胎萎不长、胎死不下及 儿科胎黄、解颅等范畴。其病因多为先天察赋不足或后天失养，以致正气 不足，卫外不固而感染邪毒，其性热，具有传染性。机体因为正气不足， 湿毒( 湿热疫毒) 内侵，病机以孕后月经闭止，阴血聚下以养胎元，整个机 体处于阴液不足的状态，湿毒乘虚侵入，与热相互搏结，滞于胞宫、胞脉。 湿毒与热相搏，两
10、因相感，传及胎儿，湿中蕴热，湿热蒸腾，蒙蔽于上， 清阳被阻，清窍奎塞不通，则可现耳聋、小头畸形、胎黄等病证。湿热秽 毒重浊粘腻，既难骤解，故病程较长。妇人良方云：“妊娠下血，因冷 热不调，七情失宜，气血不和所致。若伤于胎，则痛而下血，甚则胎坠感。” 本症属中医的“胎漏力，“胎动不安“ 、“坠胎并、“小产“ 、“死胎不下“ 范 畴。本病的发生主要是冲任不固，不能摄血养胎所致。导致冲任不固的机 理则有肾虚、血热，血瘀、气血虚弱等。因此，治疗有补肾、凉血、活血、 养血益气等方法。 2 现代医学对本病的认识 巨细胞病毒感染人体后，在正常宿主中多为潜伏性感染，极少引起临 床疾病。在免疫缺损性宿主和先天性
11、感染的婴儿中，可引起严重的巨细胞 病毒疾病，严重危害新生儿的健康，影响出生人口质量。在孕妇中，由于妇 女妊娠后，内分泌机能和代谢机能的改变，容易激活处于潜伏期的H C M V ， 造成H C M V 复发感染。一旦孕妇复发感染巨细胞病毒，临床上常表现为反复 流产、早产、死胎、先天性畸形、新生儿死亡、先天愚型、足月小样儿、 脑瘫、新生儿黄疸、幼儿智力低下等。在胎儿、婴儿和儿童中，一般分先 天性C M V 感染( 出生后1 2 周内分离到C M V 者) 和围产期C M V 感染( 胎儿分 娩时通过产道感染或生后通过母乳感染) 两种情况。先天性C M V 感染发病 率约为0 4 一2 4 ，严重者
12、可致流产、死胎、死产及新生儿死亡。巨细胞 湖北中医药大学2 0 1 0 届硕士学位论文 病毒感染的存活新生儿，绝大多数无明显症状和体征，仅约10 出现低体 重、黄疸、紫癜、肝脾大、智力障碍、视网膜脉络膜炎、脑内钙化、小头 症等。3 0 生后即死亡，所有幸存的婴儿中均有严重的智力低下，耳聋或眼 瞎。在出生时无临床症状的婴儿中约15 婴儿到学龄前逐步出现耳聋和中 枢神经系统异常。传染途径：成人感染巨细胞病毒的途径有性接触传播、 体液传播及血液传播。孕妇可通过胎盘垂直传播给胎儿。垂直传播包括： 宫内感染：隐性感染孕妇于妊娠最初3 个月胎儿感染率最高，妊娠后期 常不引起胎儿感染。产道感染：隐性感染孕妇
13、在妊娠后期巨细胞病毒可 被激活，从官颈管排出巨细胞病毒，胎儿经软产道娩出时，接触或吞咽含 病毒的宫颈分泌物和血液而感染。出生后感染：产妇唾液、乳汁、尿液 中均含巨细胞病毒，通过密切接触、哺乳等方式感染。归1 3 治法及组方分析 鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜H o u t t u y n i ac o r d a t aT h u n b 的干 燥地下部分，性辛，味微寒，归肺经，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通 淋等功能，用于肺痈吐脓、痰热喘咳、热淋、热痢、痈肿疮毒等症b 1 。鱼 腥草的抗病毒作用是其非挥发油部分，其中槲皮素等黄酮类物质的抗病毒 作用得到越来越多的关注。 槲皮素( q u e
14、r c e t i n ，3 ，3 ，4 ，5 ，7 一五羟基黄酮) 及其衍生物是 植物界分布广泛的，具有多种生物学活性的黄酮类化合物。它存在于许多 植物的花、叶、果实中，多以甙的形式存在，如芦丁、槲皮甙、金丝桃甙等， 经酸水解可以得到H 们。近年来国内外的学者对槲皮素的理化性质、药理 作用与临床都进行了大量的研究工作，槲皮素具有去痰止咳平喘，抗炎，抗 过敏，解痉，强心，降血压，扩张冠脉，降血脂，抗心律失常、抗血小板聚集， 抗氧化，抗肿瘤等广泛的药理作用。其中，槲皮素抗病毒研究具有广阔的前 景，特别应加以深入研究口1 。 H P L C 法测定槲皮素含量的实验过程中，摸索流动相条件时，甲醇比
15、例越大出峰越早，磷酸比例增大易形成拖尾。流动相分别选择了甲醇一0 2 磷酸溶液( 6 0 ：40 ) ；乙腈一O 2 磷酸溶液( 5 5 ：4 5 ) ；甲醇一0 4 磷酸溶 鱼腥草治疗孕妇巨细胞病毒感染的临床及实验研究 液( 5 2 ：4 8 ) ；甲醇一O 4 磷酸溶液( 60 ：4O ) 进行考察，结果以甲醇- 0 4 磷酸溶液( 5 2 ：4 8 ) 分离效果好。 细胞培养实验初步探讨了临床应用鱼腥草治疗孕产妇人巨细胞病毒 感染的使用剂量在体外抗病毒的作用，结合前期使用高效液相色谱法测定 鱼腥草中抗病毒有效成分槲皮素的含量，据此剂量设计本实验药物浓度梯 度，得出与临床用药基本一致的抗病毒效果，从科研实验角度证明鱼腥草 是治疗孕产妇巨细胞病毒感染的有效药物。 近年来发现槲皮素有抗多种病毒的作用，作用机理是能抑制溶酶体 H + - A T P 酶，磷酸酯酶A ：作用，影响病毒转移基因的磷酸化，抑制病毒蛋 白和R N A 合成。国外已有人证实了槲皮素能抑制R O U S 肉瘤病毒和诱发肿 瘤的人疱疹病毒D O 。有研究表明，在单层细胞培养中槲皮素可以抑制单纯 疱疹病( H S V l ) ，脊髓灰质炎病毒( p o li o ) 1 1 - 1 2 3 ，副流感病毒3 型( P f 一3 ) 和呼 吸道合胞病毒( R S V ) 对细胞的感染，而且可以抑制病毒在细胞内的复
