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1、华中科技大学 硕士学位论文 高糖、胰岛素、糖基化终末产物对小鼠骨髓干细胞向血管内皮 细胞分化的影响 姓名：许淑芳 申请学位级别：硕士 专业：内科学（内分泌学） 指导教师：李裕明 20070501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 摘 要 第一部分 高糖对小鼠骨髓干细胞向血管内皮细胞分化的影响及胰岛素 的保护作用 摘 要 目的 观察不同浓度糖和胰岛素对骨髓干细胞 (Bone marrow stem cells, BMSCs)向内皮细胞分化能力的影响。 方法 采用不同浓度糖（5.6mmol/L、 16.7mmol/L、25mmol/L）和胰岛素（0mU/L、15mU/L ,、20
2、0mU/L）分组培养骨髓单 个核细胞，流式细胞仪检测内皮细胞表面标志 Flk- 1（VEGFR- 2） ，激光共聚焦显微镜 进一步检测并鉴定内皮细胞。结果 在相同胰岛素浓度下, 随着糖浓度升高，FLK- 1 阳性细胞计数和百分数均明显降低，均有：在 0mU/L胰岛素影响下，16.7mmol/L 糖 vs 5.6mmol/L 糖，p0.05，差异无统计学意义。在 1 0 0 g/ m l AGE 影响下，FLK- 1 阳性细胞百分数与对照组比较显著降低，p= 0 . 0 0 7 0.05， 差异无统计学意义。 在 1 0 0 g/ m l AGE 影响下，FLK- 1 阳性细胞计数与对照组比较显
3、著降低， p= 0 . 0 1 5 0.05，差异有统计 学意义。 ） 表 3 . A G E 对 B M S C 向内皮细胞分化的影响 组 别 流式检测 FLK- 1 阳性细胞百分数 显微镜下 FLK- 1 阳性细胞计数 1 0 0 g/ m l AGE 组 2 0 g/ m l AGE 组 BSA 组 7 4 . 7 4 0 . 1 6 * 7 5 . 1 8 0 . 1 4 7 5 . 2 8 0 . 2 1 1 2 8 . 2 1 . 2 * 1 3 1 . 4 1 . 2 1 3 2 . 0 1 . 4 注： p0.05 ，差异有统计学意义。* p0.01。1 0 0 g/ m l
4、AGE 组与 2 0 g/ m l AGE 组比 较， p = 0 . 0 2 5 ；1 0 0 g/ m l AGE 组与对照组比较，p = 0 . 0 0 7 。但 2 0 g/ m l AGE 组对照组比 较，p = 0.443。 A G E 对 B M S C 分化为内皮细胞的影响 从表 3 可知， 与对照组比较， 在 1 0 0 g / m l A G E 影响下，B M S C s分化为内皮细胞的数量显著减少，F L K - 1阳性细胞计数和百分数差异 均有统计学意义（p 0 . 0 1 ） ；与 2 0 g / m l A G E 组比较，在 1 0 0 g / m l A G
5、E 影响下，F L K - 1 阳性细胞计数和百分数也明显减少，差异有统计学意义（p 0 . 0 5 ） 。 讨 论 糖尿病患者出现长期的血糖和血脂代谢紊乱，易致血管内皮细胞和基底膜损害， 形成糖尿病性血管并发症19。在诸多可能机制中, 蛋白质非酶促糖基化产物的作用越 来越受到重视。糖尿病个体血清 A G E 水平显著增高, 且随糖尿病病程延长而增高20。 因此，A G E对临床糖尿病及糖尿病血管并发症治疗效果的影响值得关注。骨髓干细胞 移植对人类多种疾病的治疗有着广阔的前景，临床研究已经大量开展。采用骨髓干细 胞移植技术治疗糖尿病性血管并发症成为一种崭新的治疗方法。 本实验采用以B S A
6、和葡萄糖为原料人工制备的A G E 干预正在向内皮细胞分化的骨 髓干细胞，与单纯 B S A 干预组对照。结果表明：与对照组比较，尽管 2 0 g / m l A G E 未 使 B M S C s 分化为内皮细胞的数量显著减少，1 0 0 g / m l A G E 却使 B M S C s 分化为内皮细胞 的数量显著减少。 A G E s是体内蛋白质与葡萄糖或其他还原单糖经过一系列非酶促反应生成的稳 定的共价化合物。糖尿病患者持久的高血糖状态会导致体内许多结构和功能蛋白质 等糖基化，最终形成具有高度活性的糖基化终末产物，使细胞内功能性蛋白质合成 减少，而致内皮功能受损；细胞外基质和血液循环
7、中如白蛋白等蛋白质分子被 A G E s 修饰， 改变细胞外基质和细胞间的信号传递致细胞功能受损， 还可引起炎症因子 （如 NFkB）和诸多生长因子的大量释放， 在糖尿病血管并发症的发生与发展中起着重 要作用5。 越来越多的研究者认为A G E s 是通过干预多种细胞因子受体而改变细胞信号转导， 从而对细胞生长、分化等过程产生不良影响16。P o r t e r o - O t n 等的研究12证实了 A G E 的前体醛类物质呈时间和剂量依赖的阻止了酪氨酸自磷酸化作用，抑制细胞膜酪氨酸 激酶活性，削弱了表皮生长因子受体（E G F R ）信号。E G F R 属于酪氨酸激酶受体大家族 成员之
8、一，参与细胞生长、活力、分化及死亡等过程的调节，E G F R 信号受阻影响到其 它多种重要的细胞因子如转化生长因子（T G F ） 、胰岛素样生长因子- 1 （I G F - 1 ） 、血管 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 29 内皮生长因子( V E G F ) 等发挥效应，V E G F是促进干细胞向血管内皮细胞分化的关键因 子，通过旁分泌和自分泌的方式促进酪氨酸激酶磷酸化、增强基因转录和信号转导、 激活活化蛋白激酶，从而促进内皮细胞的分化、增殖、迁移及黏附功能，促进血管床 的形成9；I G F - 1也是一种细胞表面受体酪氨酸激酶，调整细胞代谢、生长、生存的 一系列信号
9、通路。而且，I G F - 1 、T G F 本身就可以增强 V E G F 的转录13。这与高糖导致 的 E G F R信号异常机理相似。也有人认为 A G E 影响干细胞增殖及分化存在其他信号途 径如促分裂原活化蛋白激酶（M A P K ）途经21。 T a k e u c h i等提出毒性 A G E （t o x i c A G E ，T A G E ）的名词，指出 T A G E对糖尿病人 血管功能的毒性效应22。 近来对 A G E 毒性效应的研究多聚焦在 A G E 和 A G E 受体 （R A G E ） 的共同作用上23。A G E 和 R A G E 相互作用导致血管功能
10、障碍，研究24表明：A G E 和 R A G E 在内皮细胞的结合导致促炎症转录因子 N F k B激活，炎症标记物 C R P增高，血管细 胞黏附分子1 （V C A M - 1 ）25、细胞间黏附分子1 （I C A M - 1 ） 、单核细胞趋化蛋白1 （M C P - 1 ） 、I L - 6 及 T N F 表达上调；还使 N O 合酶的活性下降、细胞 N O 缺乏，致内皮舒 张功能下降26，A G E 的积累导致血流量减少，组织细胞缺血缺氧，刺激多元醇旁路和 肾素血管紧张素（R A S ）系统27。 最近 K u m e等的一项研究表明28：A G E s还可以直接作用于人骨髓间
11、充质干细胞 （h M S C ），在 h M S C 的增殖和分化的培养中加用 A G E s 后观察到：A G E 可抑制 M S C 的增 殖并可增加 M S C的细胞凋亡。其机制可能为：A G E与其抗体（R A G E ）结合并相互作用 使得 M S C 内的活性氧簇（R O S ）产生增加，R O S 又介导 A G E 与其抗体（R A G E ）交互作用， 这种正反馈放大效应使细胞进一步受到氧化应激的攻击， 出现功能缺陷， 致使细胞 D N A 合成减少和有丝分裂障碍。采用抗 R A G E抗体可清除 A G E 介导的细胞毒性效应，逆转 对 M S C 的生长抑制作用。虽然 K
12、 u m e 等的研究证明了甘油醛来源的 A G E - 2 、羟乙醛来源 的 A G E - 3 削弱了 M S C 向脂肪组织、骨、软骨的分化能力，葡萄糖来源的 A G E - 1 对削弱 M S C向脂肪组织、骨、软骨的分化能力无显著影响，而我们的研究却证实了葡萄糖和 B S A 孵育的 A G E 削弱了 B M S C 向内皮分化的能力， 考虑可能因为采取的实验条件和实验 目的不同所造成，诸如：干预时间、血清的添加、检测指标等，但需要更多的研究证 实这些推测。 A G E 对 M S C 向内皮分化的影响是否在 7 2 h 的干预时间内产生了氧化应激， 华 中 科 技 大 学 硕 士
13、 学 位 论 文 30 也需通过 R O S 检测及抗氧化剂的使用等来验证。我们的实验显示 2 0 g / m l A G E 对 M S C 向内皮分化的影响不明显，而 1 0 0 g / m l A G E显著抑制 M S C 向内皮分化，可以推测： A G E对 M S C向内皮分化的影响呈一定的剂量依赖性，但需更多浓度组的对照研究以明 确。 也有人认为A G E s 影响干细胞增殖及分化功能存在一些非依赖R A G E 方式， 如C D 3 6 、 R L D L 、F E E L - 1 , - 2 等也可发挥 A G E 受体的功能29。 A G E s 与干细胞增殖及分化功能之间
14、的相关性研究目前在国际上刚刚起步， 有关文 献较少。A G E s 介导的细胞损伤机制也还待进一步更完整的研究阐明。我们的研究只是 在探索 A G E s 对骨髓干细胞向内皮细胞分化产生影响方面做了初步的工作， 证实了 A G E 削弱了骨髓干细胞向内皮细胞的分化能力，诸如 A G E s浓度的不同对细胞分化有何影 响、影响机制以及产生的具体临床效应等问题还更待探究。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 31 结 论 本实验中，我们培养小鼠骨髓单个核细胞，利用 V E G F 和 b F G F 对其进行诱导分化， 分别采用不同浓度葡萄糖和胰岛素交叉干预和采用 A G E 独立干预
15、细胞。 各组细胞与 P E 标记 F L K - 1 孵育结合后通过流式细胞仪检测阳性细胞百分比，激光共聚焦显微镜进一 步检测并鉴定内皮细胞。比较各干预因素对 BMSCs 向内皮细胞分化的影响。得出一 下结论： （1 ）糖浓度的升高可呈量效地减少 BMSCs分化为内皮细胞的数量。 （2 ）胰岛素可促进 BMSCs向内皮细胞的分化，但过高浓度的胰岛素不能进一步的增 进 BMSCs向内皮细胞的分化。 （3 ）糖和胰岛素联合作用对 BMSC 分化为内皮细胞的影响：高浓度葡萄糖削弱胰岛 素对 BMSCs分化为 VEC 的促进作用，胰岛素可改善高糖对 B M S C s 分化为 VEC 的 抑制作用。但
16、胰岛素的保护作用并不随其浓度的增加而增加，在各组细胞培养中， 5 . 6 m m o l / l 葡萄糖 + 1 5 m U / l 胰岛素组具有最大的分化作用。 （4 ）A G E对 B M S C s分化为内皮细胞的影响：1 0 0 g / m l A G E使 B M S C s分化为内皮细胞 的数量显著减少，2 0 g / m l A G E 对 B M S C s 分化为内皮细胞的数量影响不显著。 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 32 参考文献 1 Libby P. Bone marrow: a fountain of vascular youth? Circulation, 2003, 108:378. 2 Reyes M, Dudek A, Jahagirdar B, et al. Origin of endothelial progenitors in human post
