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1、福建医科大学 硕士学位论文 骨髓间充质干细胞对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用 姓名：薛小军 申请学位级别：硕士 专业：普通外科 指导教师：涂小煌 20100301 福建医科大掌2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文薛d 、军 骨髓间充质干细胞对大鼠小肠缺血再灌注损伤的保护作用 中文摘要 【目的】 1 建立肠缺血再灌注损伤的动物模型，了解大鼠小肠肠黏膜屏障功能受损后的病理 改变。 2 分离、培养、纯化大鼠骨髓源性间充质干细胞，获得足够的间充质干细胞，并对 其表面分子进行检测。 3 通过骨髓间充质干细胞移植治疗肠屏障功能障碍的大鼠，评价其对大鼠肠屏障功 能的保护作用。 【方法】 1 采用阻断肠系膜
2、前动脉的方法建立肠缺血再灌注损伤的模型：健康雄性S D 大鼠， 2 5 0 9 一3 5 0 9 ，氯胺酮麻醉并固定大鼠，于腹前正中线开腹，分层剪开皮毛、腹肌。找到肠 系膜前动脉，以3 c m 血管夹夹闭4 5 m i n 后开放，恢复血供。在造模后2 4 h 处死大鼠，获 取小肠病理组织，依据C h i u 小肠组织损伤评价标准对小肠损伤情况进行评分。对照组大 鼠仅作假手术。 2 采用全骨髓差异贴壁法培养获得骨髓间充质干细胞( M S C s ) ：无菌条件下取大鼠 双侧下肢股骨和胫骨，剪开骨端，D M E M 反复冲洗骨髓腔至骨干发白，将冲洗下的细胞 悬液1 0 0 0 r p m 离心5
3、 m i n ，弃去上清液，用含1 0 0 o - 1 5 胎牛血清培养液重悬后，接种于 7 5 c m 2 培养瓶，在3 7 “ C ，5 C 0 2 ，饱和湿度C 0 2 培养箱内培养，每天观察细胞生长、贴 壁情况。细胞生长至培养瓶面积约9 0 时传代，根据细胞生长情况1 ：2 或1 ：3 传代。传 至第3 代时，胰酶消化，收获细胞，流式细胞仪检测。将收获的M S C s 分入7 个E P 管， 每管约1 1 0 6 个细胞，分别为C D 2 9 及其同型对照管、C D 3 4 及其同型对照管、C D 4 5 和 C D 9 0 及其同型对照管，各管内加入相应标记抗体，避光孵育4 0 m
4、i n 后上机检测。 3 获取雄性S D 大鼠的M S C s ，传代、增殖、纯化。制作大鼠肠I 瓜模型。将第3 代 M S C s 用4 ，6 联脒2 苯基吲哚( D A P I ) 标记，荧光显微镜观察标记率。再将M S C s 制 成细胞悬液，浓度为1 1 0 6 m l ，于造模成功后6 0 m i n ，通过尾静脉注射到大鼠体内，l m l 只。对照组尾静脉注射等量生理盐水。于输注后6 h 、2 4 h 、7 2 h 分批处死大鼠，获取血液、 小肠组织等标本。检测血液I L 6 、I L 1 0 、T N F 0 【、M D A 、S O D 的浓度。小肠组织部分行 快速冰冻，荧光显
5、微镜下观察D A P I 阳性细胞；部分常规H E 染色，观察肠黏膜受损情况； 第1 页其6 3 页 福建医科大掌2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文薛d 、军 部分作免疫组化，观察肠上皮细胞坏死和增殖修复情况。 【结果】 1 夹闭肠系膜前动脉后，肠系膜动脉搏动消失，肠管变白、痉挛、皱缩，约在4 0 m i n 后肠管鼓胀、呈暗红色，恢复肠系膜前动脉血供后，肠系膜动脉恢复搏动，肠管恢复蠕 动，颜色变为鲜红色。小肠组织常规病理镜下观察多数标本肠黏膜破损、溃疡、出血， 固有层破坏、毛细血管暴露，中性粒细胞大量浸润，局部出血，甚至有固有层腺体的破 坏，肠绒毛萎缩，少数标本病理损伤较轻。C h i u
6、 小肠组织损伤评价标准评分为5 4 8 3 4 2 6 分。 2 倒置相差显微镜观察原代接种2 4 h 即可见较多细胞贴壁，外观呈纺锤形和多角形， 7 2 h 后细胞数量开始增多，细胞形态呈成纤维细胞样长梭形，培养至9 d 左右细胞汇合达 到9 0 左右，细胞呈极性排列，集落呈漩涡状。经过换液和传代后，细胞逐渐纯化，至 第3 代时，细胞形态均一，呈膜状铺展。细胞表面标记物经流式细胞仪检测，C D 2 9 阳性 率为9 8 6 、C D 9 0 阳性率9 9 6 ；而C D 3 4 、C D 4 5 为阴性，阳性率分别为0 5 6 、O 8 9 。 3 M S C s 输注治疗组大鼠的血清I L
7、 6 、T N F 0 【水平在治疗后6 h 和2 4 h 显著低于对照 组( 尸 0 1 7 8 ) ，或肠道低灌注，即尿2 4 hI F A B P 增高( E L I S A 法检 i 9 l l J 1 7m g ) ；5 、血、腹水培养细菌阳性而无其他明确感染病灶。1 加2 为诊断所必须条件， 1 加2 加3 加4 或1 加2 加5 可基本确诊，具备l 加2 加3 可作为拟诊病例。治疗上在治 疗原发病的基础上主要以营养支持和合理应用抗生素为主，目前尚无明确有效的治疗措 施。 M S C s 是一种成体多能干细胞，实验证实M S C s 有强大的免疫调节作用和多向分化潜 能。其免疫调节
8、作用表现在： M S C s 能够抑制多种免疫细胞的活性。D C 是激活初始T 细胞最重要的抗原呈递细胞，介导细胞免疫反应的第一步。M S C s 能够抑制D C 向外周迁 移、抑制其成熟，同时能够抑制D C 提呈外源性抗原物质【3 刀。M S C s 也能抑制N K 细胞、 巨噬细胞的活性。器官移植的同时联合M S C s 移植能够提高移植器官的存活率。M S C s 对T 、B 淋巴细胞也有较强的抑制作用。在混合淋巴细胞反应体系中加入M S C s ，T 细胞 的增殖活性降低大于一半【3 引，有实验显示M S C s 能够分泌N O ，提高F O X P 3m R N A 的表 达，从而抑
9、制淋巴细胞的增殖反应【3 9 1 ，这种抑制作用是依赖于细胞间的接触机制发挥的。 而低浓度的M S C s 通过非接触机制对T 细胞增殖起着促进作用【4 0 】。M S C s 可以抑制L P S 诱导的B 细胞的增殖、活化及I g G 的分泌，并能抑制B 细胞C D 4 0 L 的异位表达。 M S C s 还能分泌多种细胞因子，如粒细胞、巨噬细胞集落刺激因子，白细胞介质素等，通 过这些细胞因子，M S C s 能够发挥免疫抑制作用。M S C s 能够对T N F 发生反应【4 2 1 ，抑制 I F N Y 、I L 1 2 、T N F a 等的产生，分泌I L - 4 、I L 1
10、0 等抑制性炎症介质【4 3 1 ，而后者能够抑 制巨噬细胞和T 细胞功能、对抗I L 1 、I L 6 、I L 8 等炎症介质。 当组织损伤后，血管平滑肌细胞分泌S D F 1 ，M S C s 细胞表面表达C X C R 4 ，在S D F 1 作用下，骨髓M S C s 会被迅速动员迁移至病变处，而通过各种途径引入体内的外源性 M S C s 也会定向迁移至损伤处，然后通过细胞的变形作用迁移出血管，定位于损伤组织。 在损伤的局部M S C s 能够促进新生血管的生成从而促进组织细胞的增殖。在放射性肠损 伤的大鼠模型中，移植后M S C s 后2 个月，M S C s 主要分布N 4 ,
11、 肠黏膜上皮，少量分布到 隐窝的周斟4 4 1 。通过腹部放射的方法制造小鼠放射性肠损伤模型，受损肠道表达S D F 1 增加，用C X C R 4 修饰M S C s 能明显提高其向受损肠道迁移的能力，M S C s 定植到局部后 能降低肠黏膜的通过性，改善组织病理学损伤【4 5 1 。 在本实验中，大鼠小肠缺血再灌注损伤后，血液I L 6 、I L 1 0 、T N F 0 c 等炎症介质的 水平明显升高。采用静脉注射的方式给予M S C s 治疗后，可以观察到蓝色荧光细胞迁移 第4 6 页共6 3 页 福建医科大掌2 0 0 7 级硕士研究生毕业论文匍；小军 到损伤肠组织，I L 6 、
12、T N F a 等炎症介质的水平则相对较对照组低，而抑制性炎症介质 I L 1 0 的水平则明显较对照组高，表明M S C s 能够对大鼠体内的炎症反应水平产生影响， 并且这种影响与大鼠自身的炎症反应程度有一定的关系。在结肠损伤的小鼠模型中， M S C s 移植后主要定植于肠黏膜隐窝的结肠上皮祖细胞定居的部位，损伤和M y D 8 8 能引 导M S C s 向该部位迁移【4 6 1 ，M y D 8 8 与多种炎症性疾病均有关，提示炎症对M S C s 有趋向 作用，炎症反应水平较高的大鼠，M S C s 发挥免疫调节的作用越显著。M S C s 对与脂质氧 化有关的物质，如M D A 、
13、S O D 也产生影响。给予M S C s 治疗肠缺血再灌注损伤的大鼠， 6 h 、2 4 h 、7 2 h 的血清M D A 水平都较对照组明显低，S O D 水平也相对较高，证实M S C s 能够抑制脂质过氧化的水平，提高机体清除氧自由基的能力，降低氧自由基的浓度，对 组织的再灌注损伤起保护作用。病理及免疫组化结果表明M S C s 对肠上皮细胞的坏死和 增殖也发生影响，具体表现为上皮细胞的坏死减轻，而修复加强，对维持肠黏膜的完整 性有利。 外源性M S C s 迁移至损伤的肠组织后，对肠黏膜上皮的修复作用可能的机制有： 在小肠局部微环境的作用下直接分化为小肠上皮细胞。用M S C s
14、原位移植治疗实验性结 肠炎的大鼠，提示M S C s 可能分化为结肠间质细胞和分泌V E G F 、T G F p l 促进损伤修复 【4 7 1 。与肠干细胞相互作用，促进后者的分化发挥组织修复作用。肠干细胞是位于小肠 黏膜隐窝底部的未分化细胞，能够分化为潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞、肠吸收细 胞和M 细胞五种终末细胞，在肠上皮的增殖与分化中其重要作用。用男性的M S C s 移植 治疗非特异性结肠炎的女性患者，荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，F I S H ) 检测C D 4 5 。Y 染
15、色体阳性M S C s 主要位于靠近淋巴组织的肠隐窝中，局部上皮的再生明 显提高，表明M S C s 能够促进肠上皮的修复过程 4 8 1 。在结肠损伤的小鼠模型中，M S C s 移植后主要定植于肠黏膜隐窝的结肠上皮祖细胞定居的部位【4 6 1 ，提示M S C s 与肠道部位 的干祖细胞可能存在某种细胞间的相互促进关系。在损伤的局部M S C s 能够促进新生 血管的生成从而促进组织细胞的增殖，M S C s 能够分化为血管内皮细胞促进新生血管的生 成。实验显示M S C s 对肠道有强大的修复能力，将M S C s 直接注射到放射性肠损伤的小 鼠肠组织中，一段时间后治疗组肠黏膜及肌层的厚
16、度明显较对照组厚，溃疡的数量和面 积明显较小，存活率较对照组提高【4 9 1 。 M S C s 对过度的炎症反应对肠组织损伤的保护作用可能通过以下几个方面发挥：将 炎症反应控制在较低水平，既降低了组织的炎症损伤，又不对机体的免疫保护作用产生 第4 7 页共6 3 页 福建医科大掌2 0 0 7 簟L 硕士研究生毕业论文薛卅、军 影响。将胎儿小肠上皮细胞( f e t a li n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l l s ，F I E s ) 进行缺氧损伤，再与人 M S C s 供氧共培养后，反应体系中I L 6 、肝细胞生长因子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ，H G F ) 、 V E G F 水平升高，而c a s p a s e s 3 和e a s p a s e s 8 水平降低，F I E s 活性及增殖能力提高，提示 M
